Dejstvo etarskog ulja biljke Origanum vulgare na dermatomicete
Naučni rad
- Dejan Stojković,
- Marina Soković
- Institut za biološka istraživanja «Siniša Stanković», Bulevar Despota Stefana 142, Beograd, Srbija
Apstarkt
Etarsko ulje biljke Origanum vulgare je procenjeno za ispitivanje njegove antifungalne aktivnosti na dermatomicete Candida albicans i Trichophyton mentagrophytes. Koristeći makrodilucionu metodu, etarsko ulje je pokazalo značajan i veoma visok antifungalni potencijal.
Uvod
Sekundarni biljni metaboliti su molekuli koji nisu neophodni i direktno ne učestvuju u rastu, razviću i reprodukciji biljaka. Etarska ulja su sekundarni metaboliti biljaka i definišu se kao kompleksne smese aromatičnih, isparljivih komponenti koje se sintetišu i skladište u specijalnim sekretornim strukturama biljaka.
Origanum vulgare
Familija: Lamiacea (Labitae)
Opis: Očvrsnula, žbunasta, višegodisnja biljka, koja dostiže visinu do 90 cm. sa uspravnom, dlakavom stabljikom, tamno-zelenim ovalnim listovima i roze-purpurnim cvetovima.
Proizvodnja: Postojbina Evropa, sada kultivisana svuda u svetu, uključujući SAD, Indiju i Južnu Ameriku; ulje se uglavnom proizvodi u Rusiji, Bugarskoj i Italiji.
Druge vrste: Postoje mnoge zabune u pogledu tačne botaničke klasifikacije majorana i origano vrsta. Preko 30 različitih vrsta, a samo neke od njih se koriste za dobijanje etarskih ulja, kao što je zimski ili grčki majoran (O. heradeoticum), afričke vrste O. glandulosum, vrste iz Maroka O. virens, meksički origano Lippia graveolens ili L. palmeri i sirijski origano O. maru. Sve jedno, najproduktivnije origano ulje se dobija iz španskog origana (Thymus capitatus) i u manjoj meri iz običnog origana i divljeg majorana.
Biljna/narodna tradicija: Ovo je pravi origano iz biljne bašte, koji takodje ima veoma staru lekovitu reputaciju. Koriscen je kao tradicionalni lek za digestivne poremecaje, disajne probleme (astma, bronhitis itd.), kao i kod zapalenja usta i grla.
U Kini je koriscen za lecenje groznice, povracanja, dijareje, zutice i kod koznog svraba. Razblazeno ulje je korisceno eksterno u biljnoj medicini za glavobolje, bolove, kod ujeda i uboda.
Delovanja: Analgetik, antihelmintik, antireumatik, antiseptik, antivirotik, baktericid, karminativ, diaforetik, diuretik, fungicid, paraziticid, rubefacijens, stimulans, koleritik...
Ekstrakcija: Etarsko ulje se dobija parnom destilacijom suve biljke sa cvetovima.
Karakteristike: Bledo-zuta tecnost (tamni godinama), prijatnog, specificnog biljnog mirisa. Uspeva dobro sa lavandinom, paukovim despicem, citronelom, ruzmarinom, kamforom i sumskim kedrom.
Glavni sastojci: Karvakrol, timol, cimen, kariofilen, pinen, bisabolen, linalol, borneol, geranil acetat, linalil acetat, terpinen. Sastojci veoma variraju u skladu sa izvorom, ali ulja klasifikovana kao oregano ili oreganum imaju timol i/ili karvakrol kao svoje vecinske komponente.
Druge upotrebe: Koristi se kao mirisni sastojak za sapune, kolonjske vode i parfeme, a posebno kod muskih mirisa. U proizvodnji mesa i pica se koristi kao zacin.(2)
Postoje različiti podaci o broju opasnih vrsta gljiva. Prema Hawskwart i sar. (1996) do sada je opisano 72.000 vrsta gljiva, a svake godine se opiše još oko 1.700 novih vrsta za nauku. Kako su gljive nedovoljno istražene procenjuje se da postoji oko 1,6 miliona vrsta. Smatra se da oko 100 vrsta mogu biti patogene za čoveka.
Sekundarni metaboliti fam. Lamiaceae
Biljno carstvo predstavlja veliki rezervoar jedinjenja koja imaju lekovita svojstva.
Od 250.000 ispitivanih biljnih vrsta na Zemlji, samo mali procenat ispitan je fitohemijski, a još manji deo podvrgnut je farmakološkom ispitivanju. Uzimajući u obzir da biljke mogu sadržati stotine ili čak hiljade metabolita, postoji veliko interesovanje za fitohemijsko ispitivanje biljaka, a naročito se u zadnjih desetak godina vrše biološka i farmakološka ispitivanja sekundarnih biljnih metabolita. Značaj ovih istraživanja je pre svega aplikativan jer može naći primenu u farmaciji i medicini.
Etarska ulja
Opšte karakteristike
Etarska ulja su sekundarni metaboliti biljaka i definišu se kao kompleksne smeše aromatičnih, isparljivih komponenti koje se sintetišu i skladište u specijalnim sekretornim strukturama biljaka (H e g n a u e r, 1982). Pripadaju velikoj familiji prirodnih jedinjenja-lipidima. Najčešće su biljnog porekla, sem skvalena i abreina koji se sintetišu u životinjskim organizmima. Za njihovu identifikaciju najčešće se koristi GC (gasna hromatografija) i GC/MS (gasna hromatografija-masena spektrometrija), kombinacija ovih metoda omogućava razdvajanje (GC) i identifikaciju komponenti (MS), (M i l o s a v l j e v i ć, 1994).2.1. FUNGI
Kliničke slike mikoza i njihovi izazivači
Kao paraziti na čoveku i životinjama, gljive mogu napasti kožu i keratinozno tkivo (nokte, dlaku, kosu) ili unutrašnje organe (pluća, mozak i dr.). Mikoze možemo podeliti na: površinske, duboke, opšte ili sistematske, oportunističke.
Površinske mikoze
U grupu parazitskih oboljenja kože spadaju sve dermatomikoze koje se javljaju kod ljudi i životinja, a izazivaju ih gljive, mikomicete.
Dermatomicete mogu izazvati infekcije kože, kose i noktiju zahvaljujući svojoj sposobnosti korišćenja keratina.
Dermatomikoze prouzrokuju gljive svrstane u tri roda: Epidermophyton, Trichophyton i Microsporum.
a) Trihofitije su oboljenju kože i dlaka uključivši i lanugo dlake. Prenose se direktno ili indirektno. Trihofitije su česta oboljenja i najrasprostranjenije mikoze. Prema mestu pojave lezija, prema visini lokalizacije u koži i stepenu infekcije, trihofitije se mogu grupisati na: površinske, poludubokog i dubokog oblika ili prema položaju gde su smeštene, npr. trihofitije dlanova i tabana, trihofitije obraslih i neobraslih delova tela.
Površinski oblici trihofitija javljaju se na neobraslim delovima kože, odnosno na koži pokrivenoj lanugo maljama.
Duboke trihofitije izaziva Trichophyton mentagrophytes gljiva animalnog porekla. Bolest se najčešće uočava na obraslim, dlakavim delovima tela, naročito na glavi, pod pazuhom i preponama. Kosa sa obolelih mesta je krta, dekolorisana i vrlo lako opada.
Neki trihofitoni mogu na ekstenzornim stranama ruku i podlaktica i delovima vrata posle kraćeg lako upaljenog stadijuma dovesti do dublje infiltracije, gnojenja i stvaranja apscesa. Jedno ili više takvih žarišta koja se brzo šire, pokriveno je obilnim gnojem ili krastama.
Oportunističke mikoze
Za neke gljive se smatra da mogu izazvati infekciju samo kod imunosenzibilnih osoba, pa se stoga svrstavaju u grupu oportunističkih mikoza.
Kandidijaze su oboljenja koja izazivaju gljivice iz roda Candida. Najčešći izazivač je Candida albicans. Ona je normalni stanovnik sluzokože usta i intestinalnog trakta i nalazi se u epitelnom tkivu tzv. "Y" obliku. Patogeni oblik gljive je "M" oblik i izaziva niz promena. Najčešće obolevaju deca, zatim osobe koje su po prirodi zanimanja izložene vlazi (pekari, domaćice, spremačice). Naročito su osetljive osobe koje boluju od diabetes melitis a koji smanjuje imunitet i prirodnu otpornost. Kod novorođenčadi i male dece patološke promene se nalaze obilno na sluzokoži usne duplje i nepčanim lukovima. Promene su u vidu prljavo-belih naslaga različite veličine i nazivaju se sor ili mlečac. Praćen je crvenilom na uglovima usana, to je anqulus infectiosus ili žvale, sekundarna infekcija bakterijama. Kožne lezije dece mogu biti lokalizovane oko anusa, pupka, kao i interdigitalno. Karakterišu se eritematoznim promenama koje su crvene, sjajne, kao da su lakirane.(1)
Taksonomski položaj testiranih vrsta Carstvo: Mycota/Fungi (Micetalia)
Razdeo: EumycotaPodrazdeo: Deuteromycotina
Materijal i metode
Sinteticki fungicid
Bifonanzol (bicutrin) - antimikotik, C22H18N2
Losion bifanzol sadrzi 1g aktivne supstance u lOOml razblazenog etanola uz dodatak solubilizatora i glicerola.(1)
Tretirani izolati
Micomicete su izolovane direktno sa pacijenata u Centru za preventivnu medicinu, a uzete iz laboratorije za Mikologiju, Odeljenje za biljnu fiziologiju, institut za bioloska istrazivanja "Sinisa Stankovic", Beograd. Za istrazivanje antifungalne aktivnosti in vitro koriscene su mikomicete: Trichophyton mentagrophytes i Candida albicans.
Podloga
Sabouraud-dextrozni agar
- Sabouraud- dextrozni agar................ 65g
- Cikloheksamid.................................. 0,5g
- Hloramfenikol.................................. Ix250g (kapsula)
- Gentamicin....................................... 0,65ml
- Destilovana voda..............................1000ml
- pH=5,6 (reguliše se uz pomoć 1N NaOH)
In vitro test za odredivanje antifungalne aktivnosti
Za ispitivanje antifungalne aktivnosti etarskog ulja, in vitro, koriščena je makrodiluciona metoda na Petri kutijama. Testirane su 2 mikomicete izolovane sa pacijenata u centru za preventivnu medicinu, VMA, a uzete iz Mikoteke Mikološke laboratorije, Odeljenje za biljnu fiziologiju, institut za biološka istraživanja "Siniša Stankovič", Beograd.
Makrodiluciona metoda
Dermatomicete su gajene na hranljivoj podlozi, u Petri kutijama, na 20°C u trajanju od 21 dan. Ispitivanje antifungalne aktivnosti ulja vršeno je metodom merenja brzine rasta micelija (makrodiluciona metoda). Etarsko ulje je u željenim koncentracijama, dodavano u rastopljeni medijum. Nakon hladjenja medijuma vršena je inokulacija gljiva. Merenje rasta pračeno je svakih 7 dana i poredjeno sa kontrolom. Posle inkubacije u trajanju od 3 nedelja meren je rast micelija i odredjivana minimalna inhibitorna koncentracija (MIC).
Minimalna inhibitorna koncentracija fungicida je odredena onda kada je postignuto kompletno zaustavljanje rasta micelije na medijumu u koji je dodat fimgicid.(1)
Rezultati i diskusija
Opis testiranih vrsta mikromiceta
Trichophyton mentagrophytes
Ime roda od latinskog trich-dlakav, phyton-biljka, po staroj sistematici. Ime vrste mentagrophytes-rast u vidu vitica.Opis: U kuturi raste umereno, razlikuju se tri morfološke forme: granularna, somotasta i paperjasta. Granularna forma kolonije raste umereno, ravne je površine, žuto-mrke boje, naličje žuto ili crveno-braonkasto. Somotasta kolonija sa ravnom površinom, bela do belo-krem, naličje belo-krem, retko crveno-braon. Paperjasta forma sa ravnom površinom, bele boje. Prisustne su spiralne hife. Makrokonidije u obliku cigare, sa tankim zidovima, malo naslonjene na hife, sa 2-5 septi, 6 x 20 ^im do 8 x 50 nm. Okrugle mikrokonidije, sakupljene u grozdove, brojne, 1-2 septe, 2—4
Etiologija i ekologija: Antropofilna i zoofilna (glodari, sisari) vrsta, nalazi se i u zemljištu. Inficira stopala, telo, nokte, bradu, kožu lobanje, ruke i prepone. Antropofilne vrste ne inficiraju kosu. Široko je rasprostranjena (Christensen, 1977).(1)
Candida albicans
Opis: Na Sabouraud agru kolonije su bele do krem boje, glatke i kvasicastog postojanja. Spore nastaju duz fragmentiranih vlakana i postaju tako brojne de cela vlakna mogu da budu nejasna. Spore mogu da se reprodukuju. Mikroskopska morfologija pokazuje sferne do subsferne kvasicaste celije ili blastokonidije 20-70x30-85 mikrometra po velicini
Etiologija: Candida albicans je ovalni kvasac koji pokazuje polimorfizam kao i njegove forme: pseudohife i prave hife. Postoje preko 100 vrsta ovog roda. Druge patoloske vrste se uglavnom srecu kod pacijenata sa oslabljenim imunim sistemom ukljucujuci: Candida tropicalis, Candida parapsilolis, Candida pseudotropicalis i dr.Ekologija: Kolonija je prisutna u ustima 20%, a fekalna kolonija u 40-67% kod zdravih Ijudi. Stopa se povecava kod hospitalizovanih pacijenata i posle antibakterijske terapije. Antibiotici povecavaju opseg transporta, broj organizama i potencijal za invaziju tkiva.
Candida albicans (prilog 1) je pokazala rezistentnost na sintetički fungicid, sto u ovom slučaju predstavlja bifonazol, dok je pokazala malu ili nikakvu otpornost na 'origano ulje'. Slike u gornjem redu, posmatrane sa leve na desnu stranu predstavljaju Candidu albicans u Petri kutijama sa dodatkom etarskog ulja biljke Origanum vulgare. U prvoj Petri kutiji se nalazi dodato ulje od 0.125 µl/ml i ovde se može zapaziti da je nakon završetka inkubacije u trajanju od 3 nedelje, odnosno 21 dan, u odnosu na kontrolu rast znatno umanjen. U drugoj kutiji je ulje od 0.25 µl/ml i tu se takodje u odnosu na kontrolu i bifanzol može zapaziti usporavanje rasta. U trećoj kutiji dodatak origano ulja je 0.5 µl/ml, a kompletno zaustavljen rast se vidi iz prilozene slike. Minimalnom inhibitornom koncentracijom (MIC) se postize kompletno zaustavljanje rasta micelija, a koncentracija iznosi 1 µl/ml.
U donjem redu prva slika predstavlja dodatak bifonazola od 5 µl/ml, a druga slika predstavlja kontrolu rasta micelije.
Prilog 2 predstavlja slike dermatomicete Trichophyton menthagrophytes. Na prvoj slici je dodato u Petri kutiji origano ulje u koncentraciji od 1 µl/ml i uporedjivan rast micelija sa kontrolom (leva slika), sintetičkim fungicidom bifonazolom. Ova koncentracija je ujedno i minimalna inhibitorna koncentracija (MIC), kojom se postiže kompletno zaustavljanje rasta micelija. Inkubacija traje 21 dan, a rast je posmatran svaki sedmi dan.
Prilog 3 predstavlja takodje Trichophyton mentagrophytes, ali u ovom slučaju je dodat sintetički fungicid bifonazol u koncentraciji od 5 µl/ml.
Rezultati hemijske analize etraskog ulja pokazali su da većinski sastojci: karvakrol koji je najviše zastupljen u ulju (43,5 %), p-cymen (5,43 %), timol (2,99 %), b-kariofilen (1,89 %). Ostali sastojci su zastupljeni u tragovima (manje od 1 %).
Zaključak
Kao što se vidi iz priloženih slika, izvršeno je ispitivanje antifungalne aktivnosti etarskog ulja biljke Origanum vulgare, a korišćene mikomicete nisu pokazale rezistentnost na prirodni fungicid
Što se tiče etarskih ulja, oni su prirodni lekovi, koji u bliskoj budućnosti treba da imaju široku primenu u lečenju ljudi od patogenih gljiva. U nekim istraživanjima in vivo koja su radjena, neka etarska ulja nisu pokazivala skoro nikakvo oštećenje tkiva, kod domaćina mikomiceta.
