Kariološki karakteri i metode
Kariološki karakteri i metoda spadaju u oblast citotaksonomije, a odnose se na broj, oblik i ponašanje hromozoma i upotrebu ovih, kao i citohemijskih informacija u klasifikovanju organizama.
Od karioloških (citogenetičkih) karaktera u prošlosti je pre svega korišćen broj hromozoma (uglavnom za niže nivoe klasifikacije), da bi se vremenom saznalo da i struktura kariograma prema morfološkim tipovima hromozoma predstavlja karakter bitne taksonomske težina, npr. kod blizanačkih vrsta, gde citogenetički karakteri, u odsustvu morfoloških razlika, imaju poseban značaj.
Sadržaj
Kariotipovi
Kod eukariotskih organizama genom u jedru je organizovan u hromozome čiji broj varira od vrste do vrste krećući se od haploidnog broja (n) 1, na primer kod vrste mrava Myrmecia pilosula i nematode Proascaris, do preko 200 kod nekih vrsta leptira, pa čak i do 250 kod nekih vrsta paprati (Imai i Taylor, 1989; Sivarajan, 1991). Dok je genetički kontrolisana varijabilnost karakteristika konačni rezultat različitosti nukleotidnih sekvenci unutar ekspresovanih gena, znatni fizički rearanžmani genoma u hromozomima uglavnom neće ispoljiti efekte na normalan razvoj organizama, njihovu fiziologiju ili ponašanje sve dotle dok broj funkcionalnih gena ostaje nenarušen i dok ovi geni nisu odvojeni od svojih kontrolnih regiona. Međutim, hromozomski rearanžmani, nastali kao rezultat ukrštanja individua različitih kariotipova, mogu imati velik uticaj na plodnost potomstva i s toga velik evolutivni značaj (Jackson, 1976, 1982; Maynard i Smith, 1989). Osim toga, informacije o kariotipu čine nezavisni set podataka za filogenetsku analizu i verovatno su najkorisnije za proučavanje grupa bliskih i morfološki sličnih organizama.
Interpretacija, karakterizacija i identifikacija celokupnog ćelijskog seta hromozoma naziva se kariotipizacija i prvi je stupanj u procesu korišćenja hromozomskih karakteristika u svrhe sistematike. Kod mnogih organizama je kariotipizacija relativno jednostavna, ukoliko se prati odgovarajući protokol. Međutim, kod nekih grupa prisustvo većeg broja malih hromozoma ili generalno veoma male dimenzije ćelije mogu ovaj proces učiniti komplikovanijim. Na primer, većina ptica ima mali broj hromozoma normalne veličine, ali i velik broj mikrohromozoma koji se teško broje, a kamoli identifikuju.
Kariotipovi u okviru populacija vrsta koje se međusobno razmnožavaju su obično upadljivo konstantni (iako postoje izuzeci), verovatno usled široko rasprostranjene pojave smanjenja fekunditeta nakon ukrštanja individua različitih kariotipova (mana hibrida). Međutim, jasno je da je bar u slučaju malih izolovanih populacija fiksiranje modifikovanih kariotipova jednostavno, pa prema tome kariotipovi mogu obezbediti dosta korisnih informacija o evoluciji grupe, utoliko pre što je geografska izolovanost verovatno najvažniji oblik specijacije.
Varijacije kariotipova podrazumevaju nekoliko vrsta promena. Ponekad cela hromozomska garnitura može biti umnožena što dovodi do poliploidije koja i sama može da se pojavi u nekoliko oblika. Moguće je da se pojave rearanžmani delova hromozoma (translokacije i inverzije) ili može doći do gubitka ili dodavanja pojedinačnih hromozoma bilo da je to zbog greske u procesu migracije u ćerke ćelije tokom mejoze, ili što je verovatno važnije, fuzijom jednog hromozoma sa drugim, a može doći i do fragmentacije hromozoma, premda je to manje uobičajeno.
Stepen varijabilnosti broja hromozoma kod srodnih vrsta je podložan velikoj raznovrsnosti. Čak i kod nekih grupa blisko srodnih vrsta broj hromozoma može da bude upadljivo različit, kao što je to slučaj sa muntjak jelenom kod koga kineska podvrsta ima haploidni broj hromozoma (n) 23, a indijska podvrsta ima svega 3 i jedan polni hromozom. Još ekstremniji primer je različitost zabeležena kod mrava roda Myrmecia kod kog n varira od 1 do 42 (Imai i Taylor, 1989). Kao upadljiv kontrast ovim primerima, može se kod nekih grupa organizama opaziti znatna doslednost u broju hromozoma. Na primer, kod redova Lepidoptera i Trichoptera koji su međusobno divergirali bar pre 65 miliona godina, tokom kasnog perioda krede, uobičajeni broj hromozoma je približno jednak (n=30 ili 31). Čak i u slučajevima kada se broj hromozoma znatno razlikuje od ovih vrednosti, ukupan sadržaj genomske DNK je zapravo stabilan, što ukazuje na to da poliploidija nije kod ovih insekata bila značajan faktor. Sličnu postojanost u broju hromozoma pokazuju i košljoribe kod kojih je n=24 daleko najčešća vrednost, iako opseg vrednosti varira od n=11 do n=60 (Hinegardner i Rosen, 1972).
Poseban problem u ovoj oblasti može se pojaviti u slučajevima autopoliploidije koja se javlja u različitim stepenima, kao što je to slučaj sa znatnim brojem biljaka. U slučajevima gde je moguće da između biljaka različitog stepena ploidije postoje i morfološke razlike, uobičajeno je različite kariotipove smatrati različitim vrstama. Međutim, u nekim slučajevima između individua sa vrlo različitim brojem hromozoma nema morfoloških razlika (npr. Galium aparine podrazumeva individue sa 2n=22, 44, 66 i 88) i tada se ovakvi organizmi zadržavaju u okviru jedne vrste uprkos tome što posledice interbridinga često nisu potpuno jasne. Sam broj hromozoma je uobičajeno slab indikator filogenije jer promene u njegovom broju mogu poticati od više uzroka, npr. broj će biti smanjen za jedan bez obzira na to koji se hromozm gubi ili koji od mnogih mogućih kombinacija parova biva spojen. S toga, da bi se broj hromozoma svrsishodnije koristio neophodno je identifikovati pojedinačne hromozome.
Identifikacija homologih hromozoma kod primeraka iste ili blisko srodnih vrsta može biti teška. Srećom, kod mnogih vrsta, neki ili svi hromozomi imaju osobenu i postojanu morfologiju i/ili hemijske karakteristike, što može omogućiti prepoznavanje pojedinačnih hromozoma. Morfološke razlike podrazumevaju veličinu hromozoma i položaj centromere. U pljuvačnim žlezdama nekih mušica pronađeni su veliki politeni hromozomi koji imaju prirodan šablon traka što omogućuje prepoznavanje ne samo pojedinačnih hromozoma, nego i malih hromozomskih segmenata. Kod mnogih drugih vrsta, razlike u gustini hromatina i heterohromatina duž hromozoma, kao i razlike u relativnoj količini DNK bogate A-T i DNK bogate C-G parovima na kracima hromozoma, mogu se otkriti nakon odgovarajućih tehnika bojenja omogućujući na taj način identifikovanje pojedinih hromozoma ili delova hromozoma.
Letimičan pregled kariotipova nekoliko različitih organizama pokazuje da je kod nekih dominantan metacentrični tip hromozoma, dok je kod drugih velika zastupljenost akrocentričnih i/ili telocentričnih hromozoma (Sl. 1). Ovakve razlike su uočljive čak i kod prilično srodnih taksona kao što su vrste u okviru jednog roda ili rodovi u okviru jedne porodice. Razlike u položaju centromere prisutne su na primer kod roda didelfida Marmosa, gde centromere mogu biti na X-hromozomu postavljene metacentrično (M. robinsoni), submetacentrično (M. murina) ili akrocentrično (M. alstoni).
Na žalost, promene u broju hromozoma ili, kao što je slučaj kod biljaka, nivo ploidnosti onemogućavaju ocenu statusa karaktera homologih hromozoma u različitim taksonima i prema tome ukoliko se ove varijacije koriste u taksonomske svrhe, često je neophodno odrediti indeks asimetrije krakova hromozoma. Pogodna mera je intrahromozomalni indeks asimetrije, A1 (Zarco, 1986)
gde bi i Bi predstavljaju dužine najkraćeg i najdužeg kraka n hromozoma u kariotipu. Vrednost ovog indeksa biće bliže nuli ako su hromozomi metacentrični, a blizu jedinici ako su telocentrični.
Jedan od parametara kojim je pokušana da se iskaže morfološka struktura kariograma bio je i broj hromomera (NF). Ovim je samo delimično postignut napredak u klasifikovanju srodnih taksona, kod kojih su preraspodele hromozomskih delova veoma česte
Hromozomske trake
DNK nije homogena duž krakova hromozoma. Tokom mitoze i mejoze, u metafaznim pripremama, mogu se uočiti lokalne varijacije stepena kondenzacije hromatina od kog se formira heterohromatin. Ostale razlike, kao što su odnos A+T prema C+G i koncentracija, kompozicija i dužina repetitivnih sekvenci mogu postati uočljive specifičnijim tehnikama bojenja.
Frekvenca hijazmi
Krosingoveri su uočljivi u diplotenu mejoze, kada obezbeđuju vizuelni dokaz procesa razmene genetskog materijala između sestrinskih hromozoma. Frekvencija hijazmi genetički je kontrolisana, a broj krosingovera u mejozi teži da bude relativno konstantan u okviru podvrste ili vrste i često se razlikuje između različitih vrsta i podvrsta. Prema tome, frekvencija hijazmi može biti uzeta kao taksonomska karakteristika.
Frekvencija hijazmi se takođe može uzeti kao faktor za procenu homologije dva seta hromozoma prisutnih kod hibridnih individua ukoliko se ona uporedi sa brojem uočenim kod roditeljskih vrsta (Jackson, 1984). Ukoliko dva seta hromozoma imaju visok stepen homologije, ne očekuje se smanjenje broja hijazmi. Generalno, otkriveno je da interspecies hibridi, kao i hibridi različitih sojeva jedne vrste, pokazuju smanjenu frekvenciju krosingovera.
Inverzije, translokacije i njihov značaj
Inverzije i translokacije su dve forme hromozomskih rearanžmana sa značajnim posledicama po genetičku kompatibilnost organizama koji se polno razmnožavaju. Kod inverzija segment hromozoma biva ponovno umetnut na isti hromozom, ali nakon rotacije za 180º (Sl. 2), dok se kod translokacija segment hromozoma odvaja sa jednog mesta i umeće na neko drugo mesto u genomu, bilo na istom ili na nekom drugom hromozomu. Inverzije mogu da uključe samo jedan krak hromozoma, ali i centromeru, pa se u odnosu na to nazivaju paracentrične, odnosno pericentrične inverzije. Inverzije i drugi hromozomski rearanžmani su verovatno najviše proučavani na mušicama (Diptera) budući da one poseduju trakaste džinovske politene hromozome na kojima su promene lako uočljive i na kojima je moguće definisanje angažovanih hromozomskih segmenata.
Značaj ovih hromozomskih rearanžmana je u taksonomiji dvostruk. Najpre, oni su karakteri koji se mogu uočiti, npr. kod politenih hromozoma ili drugog materijala koji se može bojiti određenim tehnikama, a potom koristiti u filogenetskim analizama. Kao drugo, sparivanje normalnog hromozoma i hromozoma sa inverzijom ili translokacijom tokom mejoze može imati znatan uticaj na fertilnost hibridnih organizama. Tokom mejoze odvija se sparivanje homologih hromozoma (poreklom od majčinog i očevog haploidnog hromozomskog seta) i razmena hromozomskih segmenata između ovih parova. Pod normalnim okolnostima svaki ovako nastao rekombinovan hromozom ima isti genski sastav, ali sadrži gene poreklom od dva roditeljska seta reorganizovane između homologih hromatida. Međutim, kada na nekom hromozomu iz jednog od haploidnih setova dođe do inverzije u odnosu na njegov homologi par i potom dođe do razmene hromozomskih segmenata, rezultat može biti nedostatak gena na jednoj od rekombinovanih hromatida i dupliranja gena na drugoj. Zigot formiran od gameta kojima ili nedostaju ili pak imaju duplirane setove gena verovatno neće opstati jer ima neizbalansirane genome. U slučaju pericentrične inverzije pojavljuju se još veći problemi s obziro da nakon krosingovera između hromozoma sa ovakvom inverzijom i njegovog homologog para mogu nastati hromatide sa dve centromere i bez centromere, što za posledicu može imati narušavanje procesa hromozomskog razdvajanja.
Da li hromozomski rearanžmani sami po sebi utiču na smanjen fekunditet, koji je često opažen kod interspecijes hibrida, još uvek je pitanje oko kog se spori. Svakako da postoji mnogo primera sprezanja hromozoma pripadnika vrsta pri čemu se sparivanje hromozoma znatno razlikuje ukoliko se radi o hromozomima sa inverzijama, translokacijama ili fuzijama, a da hibridi koji nastaju pokazuju malo ili nikakvo smanjenje fertiliteta, npr. različite Drosophila ili skakavci. I pored toga, White (1982) smatra da bi ovo mogli biti izuzeci i da isto tako postoji mnogo suprotnih primera gde mali hromozomski rearanžmani imaju drastične efekte. U svakom slučaju, svaki hromozomski rearanžman nakon pojavljivanja u populaciji važi za polimorfizam i stoga ukoliko se pokaže kao smetnja u mejotičkom sparivanju sa hromozomima bez rearanžmana, selekcija će odmah delovati protiv njega i sprečiti njegovo širenje u populaciji. Ukoliko bi to tako bilo, onda bi se samo hromozomski rearanžmani koji ne pokazuju nedostatke mogli održati ili se fiksirati u populaciji. Međutim, nekoliko argumenata i matematičkih modela pokazuje da ovakva tvrdnja predstavlja pojednostavljivanje stvari. Ukratko, rearanžmani koji bi se mogli pokazati kao smetnja u heterozigotnom obliku (npr. kao kod interspecies hibrida) mogli bi se fiksirati ukoliko bi populacije bile podeljene na manje jedinice (deme) i/ili ukoliko bi postojao značajan inbriding i/ili kada bi jedinke homozigoti za novi genski aranžman pokazale prednost u odnosu na ostale jedinke.
Značaj hromozomskih rearanžmana za filogenetske analize proističe iz njihove pretpostavljene jedinstvenosti. U tom smislu skoro da je neverovatno da data hromozomska inverzija ili translokacija može da prođe kroz obratan proces i vrati se u prvobitno stanje pošto hromozomi mogu da se prekinu i prerasporede na bilo kojoj od mnogih mogućih pozicija. Takođe se može smatrati malo verovatnim da se istovetni hromozomski rearanžman desi više od jednom tokom evolucije vrste. Međutim, iako je ovo možda na molekulskom nivou tačno, i dalje ostaje praktičan problem mogućnosti prepoznavanja razlika između dva hromozomska rearanžmana koji uključuju slične, ali ne identične transformacije. Uprkos tome, predložena jedinstvenost svake pojedine inverzije izgleda da je čvrsto potpomognuta drugim dokazima, iako se povremeno mogu naći izuzeci. Kako je Farris (1978) objasnio, jedinstveno sticanje inverzije ne isključuje obrnut proces jer dok je verovatnoća za nastanak obrnute inverzije skoro nikakva, populacija bi u odnosu na inverziju mogla da bude polimorfna i s toga bi nova inverzija mogla da se fiksira ili bi se selekcija postarala da konačno bude uklonjena iz populacije. Filogenetske analize hromozomskih rearanžmana bi prema tome pre mogle biti sprovedene pod kriterijumom parsimonije polimorfizma nego uz pretpostavku da su hromozomski rearanžmani ireverzibilni.
In situ hibridizacija
Proces in situ hibridizacije se zasniva na činjenici da se pod određenim uslovima jednostruki lanac DNK vezuje za homologi deo DNK u ćelijskom jedru ili na hromozomu i na taj način omogućuje određivanje pozicije na kojima se na hromozomima organizama pojavljuju određene sekvence gena. Praktično, veštački sintetizovana probna sekvenca DNK se označava ili radioaktivno ili u današnje vreme često visoko fluorescentnim hemijskim grupama. Zatim se na predmetnom staklu omogućuje hibridizacija hromozomske DNK sa obeleženim probama i nakon ispiranja nevezanih proba citološki preparat se može bojiti i ispitivati autoradiografski ili pod UV lampom u cilju lokalizacije proba vezanih za hromozome.
Literatura
- Goto, H. E. 1982. Animal taxonomy. London: Edward Arnold.
- Quicke, D. L. J. 1997. Principles and techniques of contemporary taxonomy. London: Blacki Academic & Professional.
- Simonović, P. 2004. Principi zoološke sistematike. Beograd: Zavod za udžbenike i nastavna sredstva.
| iz seminarskog rada Kariološki karakteri i metode u taksonomiji, Marije Markov |
