In situ hibridizacija

Proces in situ hibridizacije se zasniva na činjenici da se pod određenim uslovima jednostruki lanac DNK vezuje za homologi deo DNK u ćelijskom jedru ili na hromozomu i na taj način omogućuje određivanje pozicije na kojima se na hromozomima organizama pojavljuju određene sekvence gena. Praktično, veštački sintetizovana probna sekvenca DNK se označava ili radioaktivno ili u današnje vreme često visoko fluorescentnim hemijskim grupama. Zatim se na predmetnom staklu omogućuje hibridizacija hromozomske DNK sa obeleženim probama i nakon ispiranja nevezanih proba citološki preparat se može bojiti i ispitivati autoradiografski ili pod UV lampom u cilju lokalizacije proba vezanih za hromozome.

Generalno, ova tehnika se obično koristi za lokalizaciju gena koji se u genomu pojavljuju u mnogo kopija, npr. geni za rRNK, tRNA, određene ponovljive sekvence itd., jer je nivo radioaktivnosti ili fluorescencije koju emituje jedna proba nizak i signal neće biti dovoljno jasan. Ipak, neka istraživanja sa radioaktivo obeleženim probama pokazala su da je brojanjem srebrnih zrna raspršenih po hromozomima moguće utvrditi pozicije gena prisutnih u jednoj kopiji (ili nekoliko kopija).

Značajnu ulogu u taksonomiji in situ hibridizacija je odigrala prilikom verifikovanja pretpostavljenih hromozomskih homologija baziranih na generalnoj morfologiji i tehnikama traka, kao što je to na primer učinjeno u studiji Steinemann-a et al. (1984) sa hromozomim Drosophila obscura grupe. Ovakva uloga in situ hibridizacije može znatno da poveća pouzdanost filogenije zasnovane na pretpostavljenim hromozomskim rearanžmanima. Još jedna rastuća upotreba ove procedure je u bojenju genoma, tehnici koja se koristi za detekciju taksona koji su rezultat interspecies hibridizacije, što je čini se čest slučaj kod viših biljaka (Schwarzacher et al., 1989; Leitch et al., 1991; Bennett et al., 1992). U ovom slučaju uzima se prirodno izdvojena i potom obeležena DNK vrste za koju se smatra da je jedan od roditelja pretpostavljenog hibrida. DNK se nakon purifikacije cepa na kratke fragmente koji se obeležavaju na jednom kraju fluorescentnim markerom. Hibridizacija ovih obeležanih fragmenata sa citološkim preparatima hromozoma može pokazati manje ili više izjednačeno vezivanje ukazujući na postojanje širokog opsega homologije sekvenci, ili pak može ukazati na to da hromozomi iz preparata spadaju u dve odvojene grupe što može značiti da je ispitivana vrsta zaista hibrid koji sadrži deo genoma koji potiče od vrste od koje je dobijena DNK proba. Dalja potvrda može se steći ispitivanjem koji hromozomi su verovatno potekli od drugog roditelja, a čak je moguće koristiti i procedure sa dvostrukim obeležavanjem DNK kada se DNK jednog od roditelja obeležava jednom bojom (fluorohromom), a DNK drugog roditelja drugačije obojenim markerom. Osim toga, ovakve studije su pomogle u otkrivanju da se kod hibrida hromozomi ne mešaju nasumično tokom deobe ćelije, već hromozomi jednog roditelja teže da okruže hromozome drugog roditelja u toku metafaze.

Literatura

• Goto, H. E. 1982. Animal taxonomy. London: Edward Arnold.
• Quicke, D. L. J. 1997. Principles and techniques of contemporary taxonomy. London: Blacki Academic & Professional.
• Simonović, P. 2004. Principi zoološke sistematike. Beograd: Zavod za udžbenike i nastavna sredstva.

iz seminarskog rada Kariološki karakteri i metode u taksonomiji, Marije Markov