Tehnike u istraživanjima interakcije između proteina i DNA

Seminarski rad 

Interakcija između proteina i DNK je od velike važnosti, pa stoga postoji veliki broj tehnika koji omogućavaju njihovu identifikaciju. Postoje 3 nivoa ovih tehnika:

• metod za identifikovanje regiona DNA koji protein vezuje
• metod za čišćenje DNA regulatornih proteina
• metod za proučavanje tercijarne strukture DNA regulatornih proteina uključenih u kompleks.

Pronalaženje mesta vezivanja proteina u genomu

Prva stvar koja je otkrivena o DNA regulatornim proteinima nije njihova struktura već karkteristična sekvenca DNA koju oni prepoznaju. Mnogi proteini koji su uključeni u ekspresiju gena vezuju se za mali niz nukleotida u DNA odmah iznad gena.

Gel metoda

Slika 1

Ova metoda koristi razlike u naelektrisanju ogoljenog fragmenta DNA i DNA koji nosi vezan protein. DNA se iseca pomoću specifičnih restikcionih enzima. Tako se dobijaju DNA restrikcioni fragmenti. Jedarni ekstrakt se pomeša sa restrikcionim fragmentima. Proteini (iz jedarnog ekstrakta) će prepoznati specifična mesta i vezati se za određene fragmente. Vrši se elektroforeza na agaroznom gelu fragmenata kojima je i nije dodat jedarni ekstrakt. Ako DNA fragment ima vezan protein njegovo kretanje kroz gel će biti usporeno, tako će kompleks biti bliži startnoj poziciji. Ovo je tzv. gel retardation. Ovakav kompleks ima veću molekulsku masu nego ogoljena DNA i samim tim se sporije kreće kroz gel tokom elektroforeze. Trake nastale od fragmenata sa proteinima porede se sa trakama restrikcionih fragmenata bez proteina.

Ova metoda sa gelom daje opšte infoprmacije o položaju protein regulatornog mesta u okviru DNA sekvence ali ne precizira mesto sa velikom tačnošću. Često zakasneli fragment je dug nekoliko stotina bp a očekivana dužina regulatornog mesta je nekoliko desetina bp pa je teško odrediti tačan položaj tog regulatornog mesta u okviru datog fragmenta. Takođe ako je zakasneli fragment dug može da sadrži i odvojena regulatorna mesta za nekoliko proteina, ili pak da bude tako mali da postoji mogućnost da nekoliko nukleotida regulatornog mesta bude ukljuceno i u susedni fragment, tako da se ne formira stabilan kompleks sa proteinom i nemoze da se obavi gel analiza.

Modification protection

Slika 2

Osnova ove tehnike je da pokaže kako će DNA koja nosi protein biti zaštićena od promena. Postoje dva načina modifikovanja:

• tretiranje sa nukleazama koje cepaju sve fosfodiestarske veze sem onih gde su proteini
• izlaganje metilovanim agensima, kao što je dimetil sulfat koji dodaje metilnu grupu na G nukleotide. Svaki G nukleotid koji je zaštićen proteinom neće biti metilovan.

Oba načina zovu se footprinting.

• U prvom slučaju DNA fragment se označava na jednom kraju (radioaktivnim ili neradioaktivnim supstancama), zatim se spaja sa regulatornim proteinom (koji može biti iz jedarnog ekstrakta ili čist), i potom tretira sa deoksiribonukleazom I. Normalno deoksiribonukleaza I cepa svaku fosfodiestarsku vezu ostavljajući samo DNA segment zaštićen proteinom. Tretiranje nukleazama potrebno je limitirati uslovima kao što su visina temperature i količina enzima, da bi se raskinula samo jedna veza u fragmentu. U celoj populaciji fragmenata koje dobijamo, veza na kojoj je protein je zaštićena od delovanja nukleaza. Zatim se proteini uklanjaju, a smeša stavlja na elektroforezu i označeni fragmenti posmatraju. Svaki od fragmenata je na jednom kraju obeležen, a na drugom zasečen. Kao rezultat dobija se stepenasta struktura tako da se svaki sledeći fragment razlikuje za po jedan nukleotid. Niz stepenica je “prekinut” praznim regionom u kome se ne vide fragmenati. Ovaj region podudara se sa zaštićenim mestima na DNA tj.proteinima koji se vezuju za ovaj region. (sl. 1)

• I u drugom slučaju DNA fragmenti se označavaju na jednom kraju. Dodaje se jedarni ekstrakt i proteini zauzimaju odgovarajuće mesto na fragmentu. Potom se tretiraju sa odgovarajućom količinom dimetilsulfata tako da se jedan guanin u fragmentu metiluje. Guanin koji je zaštićen proteinom neće biti metilovan. Posle uklanjanja proteina, DNA se tretira sa piperidinom koji seče na mestima gde su modifikovani nukleotidi. Vrši se elektroforeza i kao i u predhodnom slučaju niz stepenica je “prekinut” praznim regionima u kojima se ne vide fragmenati. To su mesta koja sadrže guanin koji je bio zaštićen proteinom. (sl. 2)

Modification interference

Slika 3

Ova tehnika ne sme se pomešati sa “modification protection” jer ona ima veću osetljivost na regulatorne proteine. U ovoj tehnici pretpostavi se koji nukleotid je odgovoran za vezivanje proteina. Zatim se vrši metilacija sto može sprečiti vezivanje regulatornog proteina. DNA fragment se označi na jednom kraju, tretira sa reagensom, u ovom slučaju sa dimetilsulfatom u određenim uslovima tako da po jedan guanin u fragmentu biva metilovan; tada se dodaju regulatorni proteini ili jedarni ekstrakt i vrši elektroforeza. Posle elektroforeze uočavamo dve trake, jedno je kompleks DNA-protein, a druga sadrži DNA bez proteina. U onom DNA fragmentu gde protein nije mogao da se veže, metilovan je guanin koji je od ključnog značaja za vezivanje proteina. Da bismo identifikovali ovaj guanin, taj fragment koji nema proteina se čisti iz gela i zatim tretira sa piperidinom, potom se dobijaju dva fragmenta jedan od njih je označen, a njegova dužina se određuje u drugoj elektroforezi posle koje ćemo videti koji nukleotidi originalnog fragmenta su metilovani. Na osnovu toga se identifikuje tačno mesto DNA sekvence za koje se vezuje protein.

Slične tehnike mogu koristiti i adenin, timin i citozin nukleotide uključene u regulaciju. (sl. 3)

Izolovanje dna regulatornih proteina

Afinitativna hromatografija

DNA fragment koji sadrži regulatorno mesto može biti izdvojen u hromatografskoj koloni tako što se jedan kraj DNA kači za silika gel koji se nalazi u koloni. Proteinski ekstrakt se propušta kroz kolonu pri čemu će se regulatorni proteini vezati za odgovarajuća mesta na DNA, a ostali proteini će proći kroz kolonu. Da bi se dobio skup pročišćenih regulatornih proteina, kroz kolonu se propuste i odgovarajući reagensi. (sl. 4)

Određivanje tercijarne strukture regulatornih proteina

Kada se izoluju proteini mnogo je lakše odrediti njihovu strukturu i prirodu veze sa DNA heliksom. Za ova istraživanja najvažnije su sledeće dve tehnike: kristalografija X zracima i spektroskopskopija-jedarnom magnetnom rezonancom.

Slika 4

Kristalografija x zracima

Ova tehnika je zasnovana na difrakciji X zraka. X zraci imaju veoma malu talasnu duzinu – između 0.01 i 10 nanometara što je 4000 puta manje nego vidljiva svetlost. Ova tehnika zasniva se na difrakciji X zraka. Kada X zraci direktno padaju na kristal proteina, neki prolaze pravo dok drugi difraktuju i iz kristala izlaze pod različitim uglovima. Ako kristal sadrži iste molekule raspoređene na odgovarajući način, tada se razliciti X zraci difraktuju na isti nacin a potom međusobno inerferiraju. X zrak osetljivi film ili elektronski detektor postavljen iza kristala formira seriju mrlja. Na osnovu njihovog rasporeda i veličine, može se odrediti struktura molekula u kristalu. (sl. 5) Problem je kada imamo kompleksnije molekule i veći broj mrlja pa je i kompjuterska analiza teška i vremenski ograničena. Ako je uspešna, rezultat je elektronski gusta mapa koja nudi mapu savijenih polipeptida na osnovu čijih položaja možemo odrediti strukturu kao sto je  heliks i  ploča . Prvi proteini koji su identifikovani ovom metodom bili su mioglobin i hemoglobin.Pri otkrivanju novih proteina čeka se nekoliko meseci za kompletiranje kristalografskih analiza. U principu, često je teško dobiti odgovarajući kristal proteina. Uprkos ovom problemu broj kompletiranih struktura je porastao i sad uključuje vise od 50 DNA regulatornih proteina.

Slika 5

NMR spekroskopija -nuklearnom magetnom rezonancom

Ova metoda je nešto starija od kristalografije i potiče iz 20-og veka. Osnovni princip metode zasniva se na činjenici da rotirajuća naelektrisanja (atomska jezgra) generišu magnetni moment. Kada se atom ubaci u elektromagnetno polje on će se orijentisati tako da magnetni moment bude u pravcu polja. Svaki tip jezgra (npr.H, C, N) ima svoju specifičnu rezonantnu frekvenciju. Različiti tipovi analize (zvani COSY I TOCSY) omogućuju identifikovanje atoma vezanih hemijskim vezama za rotirajući atom. Druge analize (npr. NOESY) identifikuju atome koji su u blizini rotirajućih atoma ali nisu u direktnoj vezi sa njima. Nisu sva jezgra atoma pogodna za NMR. Zbog toga su najviše projekata NMR analize proteina H-studije čiji cilj je identifikacija hemijskog okruženja i kovalentnih veza svakog vodonikovog atoma, na osnovu čega se dobijaju informacije o unutrašnjoj strukturi proteina. Glavna prednost NMR –a je što radi sa molekulima čime su izbegnuti problemi pri X kristalografiji. Glavni nedostatak se javlja zbog zanemarivanja uticaja rotacije elektrona na magnetni moment tako da ova metoda najbolje rezultate postiže za male proteine.

Literatura

• T. A. Brown, Genomes 2, BIOS Ltd., Oxford, U.K., 2002.
• Alberts, Molecular biology of THE CELL, 4th Edition, Garland Science, 2002.

Autor teksta: Bogosavljević Miona, Brbaklić Ljiljana