DNK ''otisci''
Sadržaj
Ispitivanje biohemijske strukture DNK – stvaranje DNK „otisaka“
Postupak ekstrakcije molekula DNK
Postupak ekstrakcije molekula DNK iz tkiva ili kulture se danas sve više primenjuje u najraznoraznijim oblastima nauke – u agrokulturi, veterini, medicini, molekularnoj biologiji i mikrobiologiji... Taj postupak je sve savršeniji, brži i ekonomičniji.
Ekstrakovana DNK može da se:
- replikuje u laboratorijskim uslovima nebrojeno mnogo puta;
- Razloži na segmente da bi se podrobnije ispitali, replikovali i/ili ubacili u drugi organizam radi postizanja određenih efekata;
- Iskoristi kao vektorska DNK, tj. DNK koja će da nosi segmente strane DNK u određenom organizmu;
Često se ispituje hemijski sastav DNK, radi poređenja sa drugom (kod utvrđivanja očinstva, poređenja DNK sa mesta zločina sa DNK osumnjičenog, u molekularnoj medicini – kod ispitivanja razlika normalne i abnormalne DNK, recimo tumora, itd.).
Southern blot (saudern blot) analiza
Najjednostavnija procedura za ispitivanje hemijske strukture DNK je tzv. Southern Blot /saudern blot/. Prvo se ekstrakovana DNK zagreva na temperaturi između 80oC i 90oC, čime se dvolančani heliks razlače na jednolančane DNK (denaturacija DNK). Pod pretpostavkom da je prvih 20-ak nukleotida na 5’ kraju lanca poznato, u smešu denaturisane DNK se ubacuju takvi DNK-prajmeri (koji su veštački sintetisani) i tada se postepeno snižava temperatura. Zatim se u smešu dodaju termostabilne DNK-polimeraze kod kojih izostaje nukleazna aktivnost (recimo modifikovana polimeraza T7 ili polimeraza bakterija koje naseljavaju termalne izvore), kao i dNTP (dezoksiribo-azotbazni-trifosfat, tako postoje dATP, dGTP, dTTP, dCTP, gde je A – adenin, G-guanin, C-citozin, T-timin). Ovaj ciklus se ponavlja više puta, da bi se replikovala izdvojena DNK u dovoljnoj količini.
Ukoliko je potrebno ispitivati samo određen segment (gen), ekstrakovana DNK se obrađuje restrikcionim fermentima tako da se traženi segment izdvoji od ostatka, a zatim se za njega vežu odgovarajući DNK prajmeri, čime se omogućava samo replikacija tog segmenta. U jednom ciklusu se smeša razdvaja na četiri dela i svakom od njih dodaje se posebno 2,3-didezoksiribo-azotbazni-trifosfat (ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP), koji se specifično označava, ili radioaktivnim fosforom [α-33P] ili fluorescentnim markerima (četiri različite boje). Kada se ddNTP veže za neki lanac, prekida se replikacija DNK na tom mestu, jer za treći C-atom poslednjeg nukleotida ne može da se veže novi nukleotid, a imajući u vidu da se replikacija mnogo lanaca DNK ne odigrava istom brzinom u datoj smeši, to znači će se ddNTP vezati za različite nukleotide duž lanca DNK.
Gel-elektroforeza
Dobijene četiri smeše se stavljaju u agarozni gel u visokokoncentrovani rastvor određene soli, preko gela se stavi nitrocelulozna ili najlonska membrana, a kroz rastvor se uspostavi jednosmerno strujno kolo. Kako je DNK bogata negativno-naelektrisanim fosfatnim grupama, lanci replikovane DNK će se kretati ka pozitivnom polu u strujnom kolu, a brzina kretanja će zavisiti od veličine lanca – brži će biti manji lanci, a sporiji duži.
Detekcija
Nakon izvesnog vremena, strujno kolo se prekida, a membrana se osvetli H-zracima (kod radioaktivnog fosfora) ili UV-zracima (kod fluorescentnih markera). Tada se na membrani uočavaju četiri uspravna niza i na svakome od njih pojedina zatamnjenja koja predstavljaju nukleotide. Podaci sa membrane se čitaju od onog kraja koji je bio bliži pozitivnom polu, ka suprotnom. Jedan niz predstavlja pojavljivanje citozina, drugi guanina itd.
Zbog jednostavnosti, najčešće se prati samo pojavljivanje jedne vrste nukleotida (A, G, C ili T). Na taj način se podaci o jednom segmentu DNK mogu dobiti na jednoj traci na membrani, pa je poređenje jednostavnije.
