Juniperus excelsa Bieb. etarsko ulje i njegova antifungalna aktivnost, in vitro

Naučni rad 

Autori

Dejan Stojković, Dr Marina Soković Biološki fakultet; Ministarstvo za nauku i zaštitu životne sredine; Institut za biološka istraživanja "Siniša Stanković"

Abstrakt

Juniperus excelsa etarsko ulje je korišćeno za ispitivanje njegove aktivnosti protiv 10 patogenih gljiva (Aspergillus niger, A. flavus, Fusarium tricinctum, Penicillium ochrochloron, P. funiculosum, Phomopsis helianthi, Trichoderma viride, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum).

Bliska veza izmedju in vitro rezultata i klinickih podataka posebno mo`e da bude prikazana mikrodilucionom metodom (A.Georgii,1991) . Ulje je pokazalo znacajnu aktivnost korišćenjem ove metode.

Keywords: Juniperus excelsa, patogene gljive, mikrodiluciona metoda, antifungalna aktivnost.

Uvod

Plod Juniperus excelsa se koristi kuvan ili sirov. Tecnost dobijena iz ploda se koristi za pice. Ova biljka, a posebno plodovi, su korišceni kao tradicionalni lek za tuberkulozu, kao i kod žutice. Klekove bobice su se koistile kao aroma u kiselom kupusu, u tradicionalnoj francuskoj i nemackoj kuhinji. Kao sve`i, klekovi plodovi su davali jaci ukus smoli i dobru aromu mesu. Kad bi se jeli sirovi, verovalo se da deluju kao stimulans za povecanje apetita i takode su pogodovali kao tradicionalni lek za reumatizam i artritis. Bobice su obicno smatrane "bezbednim" lekom za trudnice koje su patile od hronicne bolesti bubrega (FAO, 1995). Ulje iz klekovog drveta je pod istragom kao prirodni pesticid ili repelent. Drvo nekih vrsta Juniperus je poznato kao otporno na truljenje, pa ograde napravljene od kedra su kvalitetne i opstaju i nakon nekoliko decenija upotrebe. Kovcezi od kedra su poznati kao bezbedna mesta za skladi{tenje vunenih proizvoda i kao za{tita od larvi moljaca i pustošenja platna. Ekstrakti iz drveta Juniperus vrsta u Nepalu su pokazali da imaju insekticidno dejstvo (Adams, 1993). Skorija laboratorijska istra`ivanja USDA Forest Service-a su ukazala na to da ovo ulje mo`e da bude efikasan termiticid kada je absorbovano u drugo drvo (Adams i sar., 1998). Mnogobrojni biljni i šamponi za kucne ljubimce sadrže ovo ulje kao aktivni sastojak (Anderson, 1995). Infekcije gljivama su sada znacajan problem u fitopatologiji, agrikulturi, industriji hrane i medicini. Zbog toga {to se pojavljuje rezistencija mikroorganizama na neke sinteticke antibiotike, brojni atifungalni cinioci su formirani kao upotrebna sredstva u tretiranju bolesti ciji su izazivaci gljive. Medicinske biljke su postale sredi{te intenzivnog skorašnjeg istraživanja, jer njihove tradicionalne upotrebe predstavljaju i potporu savremenoj farmakologiji.

Za sada postoji veoma malo podataka o istra`ivanju etarskog ulja ove biljke. Ovo ispitivanje je fokusirano na ispitivanju dejstva etarskog ulja protiv mikromiceta.

Opšte karakteristike etarskih ulja

Prvi podaci o analizi etarskih ulja poticu od J.J. Houton de Balladerre-a iz 1818, koji je još tada ustanovio da je odnos ugljenika i vodonika u takvim frakcijama 5:8. Ime terpeni ovoj klasi jedinjenja dao je Kekule (1866) izvodeci ga iz reci turpentine (terpentinsko ulje). Etarska ulja su uglavnom produkti vi{ih biljaka. Obicno se nalaze u svim delovima biljke (koren, stablo, list, cvet i plod), ali ih u najvecoj meri ima u listovima. Kod viših biljaka mogu biti zastupljena i do 30%. Kolicina etarskog ulja u biljci varira tokom njenog životnog ciklusa, opada sa starošću listova. (Sokovic, 2001)

Sastav etarskih ulja

Terpenoidi su osnovni sastojci etarskih ulja, koji su odgovorni za karakteristcan miris biljaka. Po hemijskoj strukturi to su prosti lipidi koji ne podležu saponifikaciji.

Terpenska frakcija može se podeliti na dve klase:

• C10 monoterpeni i
• C15 seskviterpeni

Ove dve klase se medusobno razlikuju po isparljivosti i tacki kljucanja (za monoterpene 140° -180°C, a za seskviterpene >200°C).

Nezasicen karakter terpena omogucuje veliki broj reakcija. Pored terpenoida (mono- i seskviterpena) u formiranju mirisa kod biljaka ucestvuju alifaticna isparljiva jedinjenja, aromaticna isparljiva jedinjenja, isparljive sustance koje sadr`e azot, sumporna jedinjenja.

== Biološka funkcija etarskih ulja

Biološke funkcije etarskih ulja mogu biti fiziološke i ekološke.

Fiziološka funkcija

1) Hormonska uloga. Proizvodnja terpena je povezana sa sintezom hormona, zbog slicnosti po strukturi i poreklu terpena sa giberilinima.

2) Uloga monoterpena u odr`avanju respiratornog sistema, odr`avanje enzimskih sistema u aktivnom stanju.

3) Uloga monoterpena kao potencijalnog izvora energije u oksido-redukcionim procesima (donori vodonika).

Ekološka funkcija

Adaptivni znacaj, uloga aktivne površine na kojoj se suncevo zracenje pretvara u toplotu, ucestvuju u smanjenju transpiracije. Mnoge biljke, narocito korovi, produkuju etarska ulja koja inhibiraju razvice zeljastih biljaka u neposrednoj okolini, cime sebi obezbeduju prednost u razvicu. Inhibitorno deluju i na biljke iste vrste. Biljke mirisom privlace oprašivace ili se štite, jer mnoge komponente etarskih ulja (npr. eugenol) poseduju jaka insekticidna svojstva.

Terapijski znacaj etarskih ulja

Pored velike raznovrsnosti moguce je izdvojiti nekoliko dejstava koje poseduje veci broj etarskih ulja: antimikrobno delovanje, aktiviraju rad disajnih organa, stimulišu rad srca i krvotoka i opuštanje glatke muskulature, antisepticko delovanje, sni`avaju krvni pritisak, pojacavaju cirkulaciju krvi, ublažavaju migrenu. Neke komponente korišćenjem u vecim kolicinama mogu izazvati neželjene efekte (npr. eugenol koji je citotoksican spada u grupu halucinogena).

Teško je ispitati aktivnost odredenih pojedinacnih komponenti etarskih ulja i vecinom se definiše farmakološka aktinost ukupnog ulja.

Pretpostavlja se da je antimikrobno dejstvo etarskih ulja rezultat sinergistickog delovanja njihovih komponenti, ali postoje mišljenja da neke od dominantnih komponenti mogu biti odgovorne za pomenutu aktivnost (Sokovic, 2001).

Fungi

Razliciti podaci postoje o broju opisanih vrsta gljiva. Prema Hawksworth i sar. (1996) do sada je opisano oko 72 000 vrsta gljiva, a svake godine se opi{e oko 1700 novih vrsta za nauku. Kako su gljive nedovoljno istra`ene, procenjuje se da postoji oko 1.6 miliona vrsta. Smatra se da oko 100 vrsta mogu biti patogene za coveka.

Dermatomikoze kao termin podrazumevaju cetiri vrste oboljenja koja se odreduju prema izazivacima. Takvu klasifikaciju su dali: Emmons, Conant, Langeron, Miloševic.

Za zemlje evropskog podrucja dovoljna je Emmonsova podela sa Gotzovom varijacijom, koja obuhvata sledece grupe:

• trihofitije,
• favus,
• mikrosporija i
• epidermofitija.

Mikrosporija je zarazna i nepredvidiva bolest, koju uzrokuju Microsporum audouini (antropofilna), Microsporum canis (zoofilna) i Microsporum gypseum (geofilna). Oboljenje se javlja u vidu epidemija po decijim ustanovama. Napada decu uzrasta izmedu 4 do 12 godina i traje do puberteta kada spontano nestaje. Manifestuje se eritematoznim `ari{tima na kosmatom delu glave. Lezije su prekrivene sitnim skramama, izgledaju kao da su posute brašnom. Nakon 3 nedelje, od pocetka bolesti, na obolelom mestu, kosa se polomi nekoliko milimetara iznad kože. Ovaj tip mikrosporije spontano se sanira u pubertetu, ali samo kod dečaka. Ta sanacija posledica je pojacanog lucenja loja pod uticajem androgenih hormona. Pri razlaganju loja nastaju masne kiseline koje ispoljavaju fungistaticki efekat suzbijajuci infekciju. Kod devojcica ne dolazi do saniranja bolesti, naprotiv i dalje se širi.

Za neke gljive se smatra da mogu izazvati infekciju samo kod imunosenzibilnih osoba, pa se stoga svrstavaju u grupu oportunistickih mikoza.

Jedan od uzroka toksicnosti mikromiceta su i jedinjenja koja one produkuju, mikotoksini. To su sekundarni metabolicki produkti koji se izlucuju u sredinu u kojoj gljive rastu, tako da se oni mogu tu zadr`ati i posle nestanka gljiva. Antibiotici mikotickog porekla, kao {to su penicilin (produkt Penicillium chrysogenum) ili grizeofulvin (produkt P. griseofluvum), takode su mikotoksini, ali naziv antibiotik se upotrebljava za supstance koje mikrorganizmi proizvode i koje su toksicne za druge mikroorganizme, dok se naziv mikotoksin odnosi na metabolicke gljivicne produkte koji su toksicni za biljke, coveka i `ivotinje. Do sada je zabele`eno oko 200 gljivicnih vrsta producenata mikotoksina. Ishrana kontaminiranim namirnicama mo`e dovesti do razlicitih oboljenja, pa mikotoksikoze predstavljaju zdravstveni problem. Simptomi su medusobno veoma razliciti, i po intenzitetu i po sindromima. Cak i blaži simptomi mogu prerasti u hronicna oboljenja. Najpoznatiji producenti mikotoksina su vrste rodova Aspergillus, Fusarium, Penicillium i Trichoderma (Muntańola-Cvetković, 1987).

Vrste roda Aspergillus (A. flavus, A. ochraceus, A. versicolor) produkuju mikotoksine, ohratoksin i aflatoksin, koji izazivaju bolest mnogih biljaka (grašak, biber, kukuruz i dr). životinje koje se hrane ovim biljkama obolevaju zbog prisustva mikotoskina, što može dovesti do gubitka ploda kod stoke. Zabeleženi su i smrtni slucajevi domacih `ivotinja zbog trovanja ohra- i aflatoksinom. Aflatoksini mogu biti letalni za živinu, a kod ljudi mogu izazvati oštecenja jetre i dovesti do pojave kancera. Smatra se da je aflatoksin B jedan od najpotentnijih, poznatih, hepatitickih kancerogena. Ohratoksin A izaziva sponatnu nefropatiju sa uvecanim i bledim bubrezima, atrofiju i degeneraciju epitela proksimalnih i distalnih tubula, intersticijalnu fibrozu, nekrozu i degeretivne promene jetre i dr.

Materijal i metode

Biljni materijal

Etarsko ulje je izolovano iz suvih bobica J. excelsa hidrodestilacijom na Clevenger aparatu u peridu od 2h. Dobijanje ovog ulja je vršeno na institutu za biološka istraživanja "Siniša Stankovic", Beograd, i kao takvo korišćeno prilikom istraživanja.

Sintetički fungicid

• Bifonazol - antimikotik

Losion bifonazol sadrzi 1g aktivne supstance u 100ml razblazenog etanola uz dodatak solubilizatora i glicerola.

• Tretirani izolati
• Mikromicete su iz laboratorije za Mikologiju, Odeljenje za biljnu fiziologiju, Institut za biološka istraživanja "Siniša Stankovic", Beograd. U istra`ivanju su kori{cene mikomicete: Aspergillus niger (ATCC 6275), A. flavus (ATCC 9643), Penicillium ochrochloron (ATCC 9112), P. funiculosum (ATCC 36839), Trichoderma viride (IAM 5061), Fusarium tricinctum (CBS 514478), Phomopsis helianthi (ATCC 201540), Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum.

Poslednja tri organizma su izolovana direktno sa pacijenata u Centru za preventivnu medicinu, laboratorija za mikrobiologiju, Vojno-Medicinska Akademija, Beograd.

Mikrodiluciona metoda

Mikromicete su gajene na malt-agar (MA) podlozi, u periodu od 21-og dana na sobnoj temperaturi i stornirane na +4°C do daljne upotrebe (Booth, 1971).

Inokulum je pripremljen tako što su isprane spore sa povšine agarnih ploca sterilnim rastvorom 0.85% NaCl-a koji sadr`i 0.1% Tween 80 (vol/vol). Suspenzija spora je sterilnim rastvorom NaCl-a dovedena do konacne koncentracije od 1.0 x 1000000 CFU/ml medijuma. Tako pripremljen inokulum držan je +4°C do upotrebe. Inokulacija je vr{ena na cvrstu podlogu (MA).

Odredivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) vršeno je serijskim razredivanjem ispitivanih komponenti rastvorenih u etanolu i emulgatoru (Tween 80). Tako pripremljeni ekstrakti etarskih ulja dodavani su u tecni medijum sa inokulumom. Mikroploce inkubirane su na 28°C u trajanju od 72 sata. Najmanja koncentracija na kojoj nije bilo rasta mikromiceta uzimana je za MIC. Minimalne fungicidne koncentracije (MFC) odredjivane su reinokulisanjem po 2 µl u 100µl tecnog medijuma i inkubirane sledecih 72h na 28°C. Ukoliko nije bilo rasta, te koncentracije uzimane su za MFC. (Hanel and Raether, 1998; Daouk et al., 1995). Kao pozitivna kontrola je korišćen komercijalni mikotik - bifonazol.

Rezultati i diskusija

Hemijska analiza ovog ulja je uradena na institutu za lekovito bilje "Dr Josif Pancic", Beograd, Srbija. Rezultati hemijske analize su prikazani u tabeli1. Prema hemijskim analizama 75.40 % testiranog ulja bio je sabinen.

Etarsko ulje je pokazalo znacajnu aktivnost protiv svih glivicnih patogena. MIC testiranog ulja su bile u opsegu 6 µl/ml - 35 µl/ml, a MFC 8 µl/ml - 45 µl/ml . Etarsko ulje pokazalo se najefikasnijim protiv fitopatogene vrste Phomopsis helianthi sa 6 µl/ml (MIC) i 8 µl/ml (MFC). Najotpornijom vrstom se pokazala Trichoderma viride sa MIC od 35 µl/ml i MFC od 45 µl/ml.

Koristili smo sinteticki fungicid bifonazol kao pozitivnu kontrolu. Bifonazol je pokazao saktivnost u mnogo vecim koncentracijama (MIC 80 µl/ml- 150 µl/ml, i MFC 100 µl/ml - 250 µl/ml) u poredenju sa Juniperus uljem, a ima {iroku upotrebu u farmaceutskoj industriji za lecenje i borbu protiv mikoza.

Hemijski sastav Juniperus excelsa etarskog ulja (u %):

• thujene = 0.95 %
• pinene = 5.20 %
• sabinene = 75.40%
• myrcene = 4.96%
• terpinene = 0.84%
• limonene = 2.25%
• terpinene = 1.39%
• terpinolene = 0.45%
• terpinene-4-ol = 1.15%
• caryophyllene = 0.15%
• humulene = 0.33%
• germacrene D = 2.15%
• cedrol = 0.58%
• C20H32 (M = 272) = 0.22%
• cauren = 1.19%
• C20H32 (M = 272) = 0.15%
• M = 266 = 0.11%
• Total = 96.32%

Pojedinacno, fenolni i afenolni alkoholi imaju najjace inhibitorno dejstvo, praceno aldehidima i ketonima. Monoterpenski ugljovodonici imaju slabiju aktivnost. Predlo`eno je da slobodna OH grupa fenola i alkohola mo`e da bude kljuc njihove aktivnosti. (Sokovic M. Van Griensven, L.J.L.D., u štampi).

Za pinen, terpinen, limonene je nadeno da oštećuju strukturne i funkcionalne osobine artificijalnih membrana. Ove komponente su pokazale da ih membrane propuštaju, izazivajuci bubrenje. One inhibišu respiratorne enzime, koji dovode do parcijalnog gubitka pH gradijenta i elektricnog potencijala, od kojih je svaki znacajan za energetski sistem u celiji. (J. Sikkema, J De Bont and B. Polman, 1994)

U ranijim istra`ivanjima otkriveno je da su neki diterpeni izolovani iz listova, semena i plodova Juniperus excelsa pokazali znacajnu aktivnost protiv bakterija (Muhammad et al., 1992; 1995; Topcu et al., 1999).

Iz rezultata mo`e da se vidi da etarsko ulje poseduje antifungalnu aktivnost protiv svih mikromiceta, ali sa razlicitom koncentracijom. Rast micelija testiranih vsta odgovorio je razlicito na istra`ivano etarsko ulje, koje pokazuje da razliciti sastojci mogu da imaju razliciti vid dejstva ili da je metabolizam nekih gljiva bio sposoban da bolje prevazide efekat ulja ili da se prilagodi na njega (Villar et al., 1986). Ocigledno je da postoji veza izmedu visoke prisutnosti sabinena u Juniperus excelsa ulju i umereno-visoke antifungalne aktivnosti ovog ulja.

Ovaj rad je pokazao da je etarsko ulje J. excelsa potencijalni inhibitor gljiva patogena hrane i mo`e da bude kori{ceno kao za{titno sredstvo hrane u malim kolicinama. Ono deluje protiv Penicillium vrsta, koje obicno inficiraju veliki broj voca, posebno citrus, protiv Fusarium vrsta, koji imficiraju mno{tvo voca i povrca ukljucujuci krastavac i paradajz i protiv Phomopsis vrsta, koje izazivaju bolesti suncokreta.

Posmatrajuci Juniperus excelsa etarsko ulje i antifungalni spektar i moc protiv znacajnih gljivicnih patogena, ono mo`e da ima potencijal kao antifungalni agent na mnogim poljima industrije. Cinjenica da je etarsko ulje prirodni proizvod cini ga privlacnim da se u daljim istra`ivanjima rasvetli mehanizam njegovog delovanja.

Reference

1) D. Marinkovic, I. Savic, B. Curcic, V. Terzija, (2001); Biologija za IV razred gimnazije, Zavod za udzbenike i nastavna sredstva, Beograd

2) M. Muntanjola-Cvetkovic, (1987) Op{ta mikologija; Beograd: Niro "Knji`evne novine"

3) S Anderson (1995): To smell a tree. J Forestry 93: 10.

4) C Booth (1971): Fungal Culture Media. In: Norris JR., Ribbons DW eds. Methods in Microbiology, Academic Press, London & New York, pp. 49-94.

5) KD Daouk, MS Dagher, JE Sattout (1995): Antifungal activity of the essential oil of Origanum syriacum L. J Food Protect 58: 1147-1149.

6) FAO (1995): Non-wood forest products from conifer. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Viale dells Terme, Rome, Italy, 8, 455.

7) H Hanel, W Raether (1988): A more sophisticated method of determining the fungicidal effect of water-insoluble preparations with a cell harvester, using miconazole as an example. Mycoses 31: 148-154.

8) K Knobloch, N Weis, H Weigand (1986): Mechanisms of antimicrobial activity of essential oils. Planta Med 6: 556-557.

9) I Muhammed, JS Mossa, FS Elferaly (1992): Antibacterial diterpenes from the leaves and seeds of Juniperus excelsa Bieb M. Phytoter Res 6: 261-264.

10) G Topcu, R Erenler, O Cakmak, CB Johansson, C Celik, HB Chai, M Pezzuto (1999): Diterpenes from the berries of Juniperus excelsa. Phytochemistry 50: 1195-1199.

11) A Villar, JL Rios, MC Recio, D Cortes, A Cave (1986): Antimicrobial activity of Benzylisoquinoline alkaloids. II. Relation between chemical composition and antimicrobial activity. Planta Med 6: 556-557.

12) RP Adams (1993): Cedar wood oil - analysis and properties. In: Linskens HF, Jackson JF, eds., Essential oils and waxes, Springer Verlag, pp. 159-173

13) Marina D. Sokovic, (2001) Doktorska disertacija Beograd: Biolo{ki fakultet

14) Christensen and Switkowski, Nucl. Phys. A280 (1977) 205

15) Gravesen, S. Frisvad, J.C, Samson, R.A.. 1994. Descriptions of some common fungi. in Microfungi. Munksgaard Copenhagen. 141.

16) RP Adams, MC McDaniel, FR Carter (1988): Termiticidal activities in the heartwood, bark/sapwood and leaves of Juniperus species from the United States. Biochem Syst Ecol 16: 453-456.

17) A.Georgii and H. C. Korting (1991): Antifungal susceptibility testing with dermatophytes, mycoses 34, 193-199.

18) Sokovic M. Van Griensven, L.J.L.D. (in press): Antimicrobial activity of essential oil and their compositions against the major pathogens of the cultivated button mushroom, Agaricus bisporus.

19) J. Sikkema, J De Bont and B. Polman (1994): J Biol Chem 269, 8022.