Metoda hipersenzitivne reakcije

Podaci o istraživačkom radu

• autor rada: Jovanović Ivana, učenica I₅ razreda XIII beogradske gimnazije
• menotor: Mr Dragutin Antonijević, Poljoprivredni fakultet, Beograd
• profesor: Desanka Dinić

Ispitivanje patogenosti vrste bakterija iz roda Pseudomonas hipersenzitivne reakcije

Uvod i cilj rada

Kao i sva druga živa bića, biljke su podložne velikom broju različitih bolesti. Parazitne (infektivne) bolesti biljaka nastaju pod dejstvom stranih organizama koji im, stupajući u kontakt sa njima, narušavaju fiziološke procese i životne funkcije. Pošto su izazvane živim organizmima koji su označeni kao infektivni i mogu da izvrše kolonizaciju i infekciju biljnog tkiva, ove bolesti se mogu preneti sa jedne biljke na drugu. Najvažniji izazivači bolesti biljaka su gljive, bakterije, virusi, fitoplazme i drugi.

Po svom značaju i štetama koje nanose gajenim biljkama, fitopatogene bakterije su na drugom mestu, posle fitopatogenih gljiva. Fitopatogene bakterije su prokariotski organizmi sposobni da na napadnutim biljkama izazovu brojne patološke poremećaje. Bolesti biljaka izazvane ovim organizmima nazivaju se bakterioze. One su veoma rasprostranjene i mogu izazvati velike ekonomske štete. U povoljnim uslovima javljaju se u epidemijskim razmerama.

Od ukupno 1600 vrsta bakterija, koje su do danas identifikovane u svetu, oko 300 čine fitopatogeni predstavnici (phyton = biljka; phatos = bolest; genein = stvoriti). Sve fitopatogene bakterije su heterotrofni organizmi. Većina njih su pravi paraziti biljaka na kojima provode ceo životni ciklus razvoja, međutim u nepovoljnim uslovima, sposobne su da prežive na biljnim ostacima (kao nekrotrofi) ili u veštačkoj sredini, na različitim hranljivim podlogama. Ovakve bakterije nazivamo fakultativnim parazitima, i to je najviši stepen koji su u evoluciji postigle. Do danas nisu otkrivene vrste bakterija koje su obligatni biotrofi.

Identifikacija fitopatogenih bakterija, kao izazivača oboljenja na biljkama, prilično je dugotrajan i komplikovan proces. Slika simptoma oboljenja samo je smernica u dijagnostici. U prirodi je primarni izazivač bolesti praćen brojnim saprofitnim vrstama koje naseljavaju izumrlo tkivo i ubrzavaju njegovo propadanje, tako da maskiraju glavnog uzročnika bolesti.

Najvažnija karakteristika neke bakterije koja napada biljke je njena patogenost, odnosno sposobnost da izazove bolest. Za dokazivanje patogenosti prisutne bakterije na biljkama, da bi se izbegla nepotrebna ispitivanja bakterije koja nije sposobna da izazove bolest, u celom svetu se koriste određena pravila poznata kao KOCH-ovi postulati. Oni podrazumevaju da je:

• fitopatogena bakterija konstantno prisutna u zaraženom tkivu
• da se određenim tehnikama izdvoji iz obolelog tkiva i odgaji u čistoj kulturi na veštačkoj hranljivoj podlozi (izolacija)
• da se dobijenom čistom kulturom veštački zarazi zdrava biljka iste vrste i sorte, kao što je bila ona sa koje je bakterija izolovana, sa ciljem ponavljanja identičnih simptoma (inokulacija)
• da se iz veštački zaražene (inokulisane) biljke ponovo izoluje bakterija i odgaji u čistoj kulturi (reizolacija)
• da se sve osobine izolata i reizolata podudaraju.

Tek kada se sve operacije završe, može se postaviti dijagnoza, odnosno tvrditi, da je baš ta bakterija prouzrokovala bolest. Sve ovo zahteva dosta vremena, određenu opremu i obučeno ljudstvo. Zbog toga je otkriće hipersenzitivne reakcije (HR) bilo revolucionarni korak u brzoj proveri patogenosti neke vrste. Ova jednostavna tehnika već za 24 sata dokazuje da li je neka bakterija fitopatogena ili ne. Ako je fitopatogena - pristupa se daljim proučavanjima, odnosno identifikaciji vrste.

Osnovni cilj ovog rada bio je da se, metodom hipersenzitivne reakcije, ispita patogenost nepoznate vrste bakterija iz roda Pseudomonas na listovima duvana i muškatle.

Teorijski osvrt na temu

Hipersenzibilnost je odavno poznata kada su u pitanju gljive i virusi kao izazivači biljnih bolesti. Njena uloga kod fitopatogenih bakterija otkrivena je tek sedamdesetih godina prošlog veka. Radeći sa bakterijama roda Pseudomonas, Zoltan Klement (1926 – 2005) sa saradnicima (Lovrekovich, Farkas, Goodman et al.) dokazao je postojanje hipersenzibilnosti i kod fitopatogenih bakterija.

Hipersenzibilna reakcija je u suštini odbrambena reakcija biljaka koja se javlja kada:

• fitopatogena bakterija dodje u kontakt sa biljkom koja nije njen prirodni domaćin (inkompatibilni odnos).
• virulentna bakterija dodje u kontakt sa otpornim domaćinom
• kada normalno osetljiv domaćin dođe u kontakt sa bakterijom koja je na bilo koji način izgubila svoju vitalnost.

Ukoliko fitopatogena vrsta dodje u kontakt sa svojim prirodnim domaćinom (kompatibilan odnos) javljaju se simptomi bolesti. Saprofitne vrste bakterija ne izazivaju hipersenzibilnu reakciju niti simptome bolesti. Iz ovoga proizilazi da hipersenzibilnu reakciju izazivaju samo fitopatogeni predstavnici zbog čega je ovaj eksperiment najbrži način za dokazivanje patogenosti ispitavane vrste.

Najznačajniji rodovi fitopatogenih bakterija koji su izazivači HR su:

• Pseudomonas spp,
• Xanthomonas spp, i
• neke vrste rodova Erwinia,
• Agrobacterium spp. i
• Clavibacter spp.

Vrste iz roda Pseudomonas proizvode HR na sobnoj temperaturi u koncentraciji od 5x10^6 – 10^7 cfu/ml (ćelija/ml). Pripadnici roda Xantomonas za ispoljavanje HR zahtevaju nešto veću koncentraciju suspenzije (10^8 - 10^9 cfu) i povišenu temperaturu (32°C). Kao test biljke koriste se listovi duvana (Tabacum sativum), muškatle (Pelargonium spp.), tatule (Datura stramonium), pomoćnice (Solanum nigrum), kao i listovi kajsije, zeleni plodovi paprike i šljive i mahune boranije.

Materijal i metode rada

• Korišćena je nepoznata bakterija iz roda Pseudomonas odgajena u čistoj kulturi na MPA (mesopeptonski agar) stara 24h
• Suspenzija koncentracije 5x10^6 – 10^7 cfu/ml dobijena dodavanjem sterilne destilovane vode u čistu kulturu bakterija. Homogenizacija suspenzije uradjena je na Vortex-u, rotacionoj mešalici, sa 1000 obrt/min. Za injektiranje suspenzije korišćen je medicinski špric kapaciteta 5 ml i insulinske igle od 2 cm.
• Kao test biljke korišćeni su listovi duvana sorte White Barley i listovi muškatle Pelgargonium zonale. Kao kontrola, pojedini listovi injektirani su sterilnom destilovanom vodom.
• Rezultati su očitavani 24h nakon injektiranja.
• Biljke su čuvane u laboratorijskim uslovima na sobnoj temperaturi.

Priprema suspenzije za injektiranje: Eksperimentalno je dokazano da se željena koncentracija suspenzije od 5x10^6 – 10^7 cfu/ml dobija tako što se dobro razvijena kultura ispitivane bakterije, odgajena na kosom MPA, stara 24h, nalije sterilnom destilovanom vodom 1 – 2 cm iznad gornjeg zakošenog dela i homogenizuje.

Pripremljenom suspenzijom injektira se mezofil listova, najčešće kroz lisne nerve, tako da suspenzija ispuni interkostalni prostor, odnosno prostor između dva nerva. Pozitivna hipersenzibilna reakcija obično se javlja 24h od injektiranja u vidu suve nekroze biljnog tkiva koje dobija sivo – maslinastu boju. Za pojavu pravih simptoma, simptoma bolesti, na odgovarajućem domaćinu sa kog je bakterija i izolovana, potreban je znatno duži period.

Rezultati i diskusija

Posle 24 časa na listovima test biljaka pojavila se suva nekroza što je ukazalo na to da su bakterije iz roda Pseudomonas koje su korišćene u radu fitopatogene.

Hipersenzibilna reakcija predstavlja jedan od vidova aktivne odbrane biljaka u koju su uključeni svi mehanizmi biohemijskog suprotstavljanja napadnutih ćelija biljke. Odigravaju se u brzo lokalizovanoj smrti jedne ili nekoliko ćelija biljke domaćina na mestu gde je patogen izazvao infekciju tako da ona predstavlja osnovni razlog zaustavljanja prodora patogena u biljku još u prvim ćelijama izloženim napadu. Smrću ovih ćelija zaustavljen je dalji razvoj bolesti. Biljka domaćin je sačuvala svoju celinu i ostala otporna. Ove reakcije se odigravaju samo u specifičnim kombinacijama domaćin – patogen, u kojima su domaćin i patogen nepodudarni jer parazit dospe u biljku koja inače nije njegova hraniteljka. Razlog njihove nepodudarnosti je postojanje gena rezistentnosti u biljci i njihovo aktiviranje onda kada se prepoznaju specifični signalni molekuli zvani potkazivači.

Reakcija preosetljivosti je jedan od najuspešnijih prirodnih mehanizama odbrane koju je izazvao patogen. To je vrhunac odbrambenih reakcija biljke. Prepoznavanjem potkazivača kod biljke domaćina nastaje niz biohemijskih reakcija u napadnutim i okolnim ćelijama. Ove promene vode do novih i izmenjenih funkcija ćelija ili do stvaranja jedinjenja koja učestvuju u odbrani.

Nakon ubrizgavanja suspenzije, oko 20 minuta traje uspostavljanje veze između bakterije i biljke domaćina. U narednih nekoliko časova dolazi do pokušaja deobe bakterijskih ćelija. Pošto ne dolazi do prepoznavanja bakterijskih ćelija od strane domaćina, biljka reaguje na nju kao na prisustvo stranog tela, dolazi do drastične promene u propustljivosti ćelijskih membrana i oslobadjanja jona iz ćelija. Svi ovi procesi dovode do kolapsa ćelija – biljka "svesno" ubija sopstvene ćelije kako bi lokalizovala širenje bakterija. U izumrlim ćelijama domaćina umiru i same bakterije.

Osnovne komponente ćelijskih membrana biljaka čine lipidi (oko 40%) i belančevine (oko 60%). U njima su posebno značajni fosfolipidi koji se nalaze u dvoslojnom rasporedu. Zajedno sa belenčevinama oni čine lipoproteinske membrane koje regulišu ulazak raznih materija kako u ćeliju tako i u njene organele. Plazmatična membrana u vidu endoplazmatičnog retukuluma i organela obezbeđuje podelu ćelija u zone čime je omogućeno istovremeno odvijanje različitih biohemijskih procesa. S druge strane, svi ti delovi su uzajamno povezani i čine mrežu koja prožima čitavu citoplazmu. Pored navedenih funkcija, plazmatična membrana je izuzetno aktivno mesto odakle se podstiču različiti mehanizmi biljke. Za plazmatičnu membranu se vezuje protein koji je kodiran genom rezistentnosti koji pokreće hipersenzibilnu reakciju. Membrana biljne ćelije koju ugrožava patogen ili produkti njegovog metabolizma (toksini) doživljava različite i duboke promene kako u strukturi tako i u propustljivosti – dolazi do povećane pokretljivosti jona posebno K+ i H+. Jedna od najzanačajnijih odbrambenih reakcija vezana za aktivnost membrane jeste oslobađanje reaktivnih kiseonočnih “radikala” i brojnih enzima. Oslobođeni kiseonični radikali podstiču proces oksidacije fosfolipida u membrani pri čemu nastaje mešavina lipidnih hidroperoksida koji su veoma toksični. Zahvaljujući njihovom delovanju dolazi do razgradnje bioloških membrana koja vodi do kolapsa biljne ćelije i, na kraju, do njene smrti. Ovaj proces odvija se i u susednim ugroženim ćelijama. Posledice su takve da se napadnute ćelije suše, nastupa nekroza lisnog tkiva i odvajanje bakterije od zdravih ćelija. Izolacija bakterije praćena je njenim izumiranjem.

Zaključak

Na test biljkama došlo je do stvaranja suve nekroze 24 sata nakon injektiranja nepoznate vrste bakterija iz roda Pseudomonas. Iz ove reakcije biljke domaćina možemo zaključiti da je vrsta bakterija koja je korišćena u eksperimentu zaista fitopatogena i da se nalazi u inkompatibilnom odnosu sa test biljkama.

Literatura

• Arsenijević, M. (1997): Bakterioze biljaka, S Print, Novi Sad
• Babović, M. (2000): Osnovi patologije biljaka, Poljoprivredni fakultet, Beograd
• Dhingra, Ph.D., Sinclair, J.B (2000): Basic Plant Pathology Methods, CRC Press, Boca Raton, Florida
• Klement, Z., Rudolph, K., Sands, D.C. (1990): Methods in phitobacteriology, Academia, Kiado, Budapest