Antifugalni potencijal etarskog ulja biljke Melaleuca cajuputi

Naučni rad 

Autori:Dejan Stojković, Nemanja Marjanović, Nikoleta Đorđevski, Slaviša Stojković, Marina Soković

• Mikološka laboratorija, Odeljenje za biljnu fiziologiju, Institut za biološka istraživanja “Siniša *Stanković”, Bulevar Despota Stefana 142, Beograd, Srbija
• Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu, Studentski Trg 16, Beograd, Srbija
• Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Vojvode Stepe 450, Beograd, Srbija

Apstrakt

Etarsko ulje biljke Melaleuca cajuputi, poreklom iz Indonezije, je procenjeno za testiranje njegovog antifungalnog potencijala na različite patogene mikromicete (Fusarium tricinctum, Phomopsis helianthi,Penicillium funiculosum, Trichoderma viride, Alternaria alternata). Među testiranim gljivama bili su i značajni producenti mikotoksina. Korišćenjem mikrodilucione metode etarsko ulje je pokazalo antifungalnu aktivnost.

Ključne reči: Antifungalni potencijal, Melaleuca cajuputi, mikrodiluciona metoda.

Uvod

Poslednjih godina postoji povećano interesovanje za upotrebu prirodnih proizvoda. Od strane naučne javnosti postavljana su različita pitanja o bezbednosti upotrebe sintetičkih jedinjenja, pa shodno tome, povećalo se i interesovanje za detaljnije studije biljaka, kao izvora prirodno-aktivnih jedinjenja. Etarska ulja, mirisni i isparljivi produkti sekundarnog biljnog metabolizma, imaju široku aplikaciju u narodnoj medicini, kao začini i konzervansi u hrani, a takođe se upotrebljavaju i u industriji parfema (D. Kalemba i A. Krunicka, 2003). Infekcije gljivama su sada značajan problem u fitopatologiji, agrikulturi, industriji hrane i medicini. Zbog toga što se pojavljuje rezistencija mikroorganizama na neke sintetičke antibiotike, brojni atifungalni činioci su formirani kao upotrebna sredstva u tretiranju bolesti čiji su izazivači gljive. Medicinske biljke su postale središte intenzivnog skorašnjeg istraživanja, jer njihove tradicionalne upotrebe predstavljaju i potporu savremenoj farmakologiji (Soković M., Griensven L., 2004).

Cilj ovog istraživanja je ispitivanje dejstva etarskog ulja biljke M. cajuputi na mikromicete.

1. Melaleuca cajuputi

1.1. Karakteristike ulja Ulje dobijeno iz biljke Melaleuca cajuputi ima prodoran miris.

1.2.Poreklo ulja Iako se ponekad navodi kao belo čajno drvo, M. cajuputi drvo vodi poreklo iz malezijskih priobalnih ravnica. Zimzeleno, čvrsto drvo koje raste do 30 metara, ima beličastu koru sunđeraste konzistencije i vijugavo stablo. Poznato je u drevnoj Indiji kao “Kayaputi” i takođe je cenjeno na Istoku zbog svoje upotrebe. Poznato je po svojim antiseptičkim osobinama, kao tradicionalni lek za bolove u stomaku, za reumatizam, koleru i kao insekticid.

1.3. Ekstrakcija Cajuput etarsko ulje se ekstrakuje iz svežih listova i grančica hidrodestilacijom.

1.4. Fitohemijski sastav Fitohemijska analiza je pokazala da su glavne komponente ovog etarskog ulja α-pinen, β-pinen, mircen, α-terpinen, limonen, 1,8-cineol, p-cimen, terpinolen, linalol, i α-terpineol (Šema 1).

1.5. Predostrožnost Cajuput ulje je netoksično, mada može da iritira kožu i mukoznu membranu kada se upotrebljava u velikim koncentracijama

1.6. Terapijski značaj Terapijski značaj navedenog ulja uključuje njegovu primenu kao: analgetika, antineuralgika, antiseptika, spazmolitika, dekongestiva, ekspektoransa, insekticida, anti-piretika, karminativa, stimulansa i tonika.

1.7. Upotrebe Povećavajući znojenje, cajuput ulje hladi telo i pomaže u tretmanu infekcija, kao što su laringitis i bronhitis. Pomaže i kod astme, sinuzitisa i bolova u grlu. Smiruje digestivni sistem, enteritis, dizenteriju. Grčevi, artritis, reumatizam i bol u mišićima se takođe mogu tretirati ovim uljem. Ne pomaže samo sa kožnim problemima kao što su akne i psorijaza, već se koristi i kao repelent za vaši i buve.

1.8. Karakteristike odabranih mikromiceta

• Alternaria alternata (Fries.) Keissler

Na MA podlozi pri temeperaturi od 25 C, formira koloniju 6-7 cm u prečniku za 7 dana. Kolonija je crna, smeđe-crna ili zelenkasto-crna (Slika 1. a). Konidiofori pojedinačni ili u grupama, granati ili negranati. Konidije diktiospore, 20-63 x 9-18 m, elipsoidne u dugačkim lancima, prostim ili razgranatim (Slika 1. b). Poseduju najčešće 8 transferzalnih i nekoliko longitudinalnih septi, sa kljunom koji ne prelazi trećinu dužine konidije (Ellis, 1971).

Saprob, zabeležena na biljkama, tkaninama i u različitim tipovima zemljišta. Temperaturni opseg za rast ove vrste je od 2-32C, optimum 25-28C. Spore imaju široku distribuciju, često su prisutne u vazduhu, kućnoj prašini, vlažnim zidovima itd.

Kultiviše se za produkciju biomase, koristi se kao izvor materije za alergenske ekstrakte u dijagnozi i tretmanu alergija izazvanih gljivama. Producent je mikotoksina (Muntañola-Cvetković, 1987).

• Diaporthe/Phomopsis helianthi Munt.-Cvet. et al.

Na MA podlozi vazdušna micelija, maslinaste boje (Slika 2. a). Na PDA podlozi micelija je oskudna, bela, piknidije se formiraju brzo u stromama. Crna boja konidiomata daje karakterističan izgled kolonija. Optimalna temperatura za rast je 23-25C u zavisnosti od podloge. Piknidije (Slika 2. b), pojedinačne ili u stromama. Konidije srpaste, jednoćelijske, -konidije (Vukojević, 2000).

Široko rasprostranjena vrsta, poznata kao patogen suncokreta. Izaziva nekroze lista i truljenje stabla suncokreta. Prvi put zabeležena i opisana u Jugoslaviji. Produkuje mikotoksin fomozin, koji u eksperimentalnim uslovima izaziva razna oštećenja na suncokretu (Muntañola-Cvetković et al., 1987; Vukojević, 2000).

• Fusarium tricinctum (Corda) Sacc.

Micelija ružičasta, paučinastog izgleda (Slika 3.). Obrazuju dva tipa konidija, makro i mikrokonidije. Makrokonidije su izdužene, septirane spore, dok su mikrokonidije jednoćelijske ovalne ili eliptične, obrazuju se pojedinačno ili su sakupljene u glavice. Makrokonidije obično formiraju sporodohije na kratkim fijalidama, eliptične. Hlamidospore retke, glatkih zidova, intercelularne, pojedinačne ili u lancima, oker-braon, violet, ređe bez boje (Booth, 1971).

Široko rasprostranjene u zemljištu i na organskim supstratima. Česti uzročnici truljenja uskladištene hrane i producenti mikotoksina (Christensen, 1977; Muntañola-Cvetković, 1987).

• Penicillium funiculosum Thom

Boja kolonije varira u zavisnosti od količine vazdušne micelije koja je somotasta, obično je žuto-narandžasta ili crvenkasta sa eksudacijom u vidu bezbojnih ili svetlo obojenih kapi. Naličje kolonije narandžasto, crvenkasto ili narandžastosmeđe boje (Slika 4.). Konidiofori često veoma kratki, obrazuju se direktno na miceliji, glatki, uglavnom negranati. Metule po 5-8 u grupi nose paralelno grupisane fijalide. Konidije eliptične ili okrugle, 2.5-5.0 m u prečniku, obrazuju dugačke lance (Škrinjar, 1979).

Široko rasprostranjena, često izolovana iz zemljišta. Vrši sintezu celulitičkih enzima. Napada mnoge materijale, naročito tekstil (Muntañola -Cvetković, 1987).

• Trichoderma viride Pers. ex Fr.

Kolonija raste brzo, do 7 cm u prečniku za 5 dana na 25o C. Boja kolonije je od beličaste, svetlo - zelene do tamno zelene (Slika 5.). Konidiofori uspravni, bezbojni, veoma razgranati, fijalide pojedinačne ili u grupama. Konidije jednoćelijske, loptaste, 3.5 - 4.5 m u prečniku (Gravsen et al., 1994).

Rasprostranjena u zemljištu, panjevima, oborenom drveću. Jedan je od prvih kolonizatora stelje, poseduje veoma jaku celulitičku aktivnost. Nalazi se takođe u vlažnim kućama, na zidovima, pločicama u kuhinji. Izolovana je iz vazduha i iz kućne prašine. Otporna je na mnoge antibiotike. Koristi se za proizvodnju celuloze i hemiceluloze. Može da akumulira DDT. Sintetiše supstance sa antibiotičkom aktivnošću, ali su one toksične za sisare (Muntañola-Cvetković, 1987; Gravsen et al., 1994).

2. Materijal i metode

2.1. Biljni materijal U istraživanju je korišćen komercijalni uzorak etarskog ulja, poreklom iz Indonezije.

2.2. Sintetički fungicid Bifonazol - antimikotik. Losion bifonazol sadrzi 1g aktivne supstance u 100ml razblazenog etanola uz dodatak solubilizatora i glicerola.

2.3. Tretirani izolati Mikromicete su iz laboratorije za Mikologiju, Odeljenje za biljnu fiziologiju, Institut za biološka istraživanja “Siniša Stanković”, Beograd. U istraživanju su korišćene sledeće mikromicete Penicillium funiculosum (ATCC 36839), Trichoderma viride (IAM 5061), Fusarium tricinctum (CBS 514478), Phomopsis helianthi (ATCC 201540), Alternaria alternata (DSM 2006).

2.4. Podloga

Tečni malt

• ekstrakt slada………..50g
• destilovana voda…….1l
• pH = 7 (reguliše se uz pomoć 1N NaOH)

2.5. Mikrodiluciona metoda

Mikromicete su gajene na malt-agar (MA) podlozi, u periodu od 7 dana na sobnoj temperaturi i stornirane na +4°C do daljne upotrebe (Booth, 1971).

Inokulum je pripremljen tako što su isprane spore sa povšine agarnih ploča sterilnim rastvorom 0.85% NaCl-a koji sadrži 0.1% Tween 80 (vol/vol). Suspenzija spora je sterilnim rastvorom NaCl-a dovedena do konačne koncentracije od 1.0 x 105 CFU/ml medijuma. Tako pripremljen inokulum držan je +4°C do upotrebe. Inokulacija je vršena na čvrstu podlogu (MA).

Etarska ulja dodavana su u tečni medijum sa inokulumom. Mikroploče su inkubirane na 28°C u trajanju od 72 sata. Najmanja koncentracija na kojoj nije bilo rasta mikromiceta (na binokularnom mikroskopu) uzimana je za MIC. Minimalne fungicidne koncentracije (MFC) odredjivane su reinokulisanjem po 2 μl u 100μl tečnog medijuma i inkubirane sledećih 72h na 28°C. Ukoliko nije bilo rasta, te koncentracije uzimane su za MFC. (Hanel and Raether, 1998; Daouk et al., 1995).

Kao pozitivna kontrola je korišćen komercijalni mikotik – bifonazol.

Rezultati i diskusija

Istraživano etarsko ulje je pokazalo umerono-visok antifungalni potencijal (prikazano u Tabeli 1 i Grafikonu 1), sa minimalnim inhibitornim koncentracijama u opsegu od 50 l/ml – 150 l/ml i sa minimalnim fungicidnim koncentracijama u opsegu od 100 l/ml – 200 l/ml. Kao jako rezistentna vrsta pokazala se Trichoderma viride sa MIC od 150 l/ml I MFC od 200 l/ml. Phomopsis helianthi je pokazao najveću senzibilnost na etarsko ulje sa MIC od 50 l/ml i MFC od 100 l/ml.

Zaključci

Ovo istraživanje je pokazalo da etarsko ulje M. cajuputi kao inhibitor rasta mikromiceta - kontaminanata hrane može da bude u upotrebi kao konzervans u hrani u malim količinama. Deluje na Penicillium vrste, koje inficiraju voće, posebno limun, na Fusarium vrste, koje inficiraju različito voće i povrće, uključujući krastavac i paradajz i na Phomopsis vrste, koje izazivaju bolesti suncokreta. Posmatrajući antifungalni spektar i potencijal etarskog ulja M. cajuputi na značajne patogene gljive, ono može da ima primenu kao antimikotik u mnogim poljima industrije. Činjenica da je etarsko ulje prirodni proizvod čini ga privlačnim za dalja istraživanja i rasvetljavanje njegovog mehanizma delovanja.

Reference

• D. Kalemba and A. Krunicka (2003): Antibacterial and Antifungal Properties of Essential Oils, Current Medicinal Chemistry 10, 813-829.
• C Booth (1971): Fungal Culture And Media. Norris JR. Ribbons DW eds. Methods in Microbiology, Academic Press, London and New York, pp. 49-94.
• H Hanel, W Raether (1988): A more sophisticated method of determining the fungicidal effect of water-insoluble preparations with a cell harvester, using miconazole as an example. Mycoses 31, 148-154.
• KD Daouk, MS Dagher, JE Sattout (1995): Antifungal activity of the essential oil of Origanum syriacum L. J Food Protect 58, 1147-1149.
• Soković M. Van Griensven, L.J.L.D. (in press): Antimicrobial activity of essential oil and their compositions against the major pathogens of the cultivated button mushroom, Agaricus bisporus.
• Ellis M. B. (1971): Dematiaceous hzphomzcetes. Commonwelth Mycological Institute, Kew, Surrey, England.
• Muntanola-Cvetković (1987): Opšta mikologija. Naučna knjiga. Beograd
• Vukojević J. (2000): Praktikum iz mikologije i lihenologije. NNK International. Beograd.
• Booth C. (1971): The genus Fusarium. Commonwealth Mzcol Inst. Kew. England.
• Christensen, C. M. (1977): Chemistry of mycotoxins. In: Mycotoxifungi, mycotoxicoses, An encyclopedia handbook, 1, Mycotoxic fungi and chemistry of mycotoxins, (eds. Wyle, T.D. & Morehause, L.G.) 190-240. Marcel *Deeker, Inc, New York and Basel.
• Škrinjar M. (1979): Mikološka aerozagađenja u raznim mestima SAP Vojvodine sa osvrtom na alergijska oboljenja. Magistarski rad. Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.
• Gravesen, S., Frisvad, C. J. & Samson, A. R. (1994): Microfungi, 74-153, Munksgaard.