Eritrociti i azot monoksid

Uloga NO u diferencijaciji RBCs, kako se pretpostavlja, je bazirana na tome da on inhibira rast, diferencijaciju i hemoglobinizaciju primarnih celija eritrocita. Bioaktivnost endotelne NOS (eNOS) mRNA i proteinski nivo se smanjuju za vreme diferencijacije RBCs, zajedno sa rastom nivoa hemoglobina (Hb). NO je hidrofoban i akumulira se u lipidnim membranama gde se odvija najveca autooksidacija u nitrite in vivo. Reakcija NO sa dezoksi Hb produkuje nitrozilhemoglobin (HbFe(II)NO), dok isti sa oksihemoglobinom, proizvodi metHb i nitrat. Nitriti sa dezoksihemoglobinom stvaraju NO. Ova reakcija kao i pretpostavljena formacija tiol-NO koje nastaju iz Hb, S-nitrozohemoglobin (SNO-Hb), izgleda da su glavni mehanizmi odbrane i transporta NO pa ga neki nazivaju i ’’hormonom’’ [8].

Kako endotelijalno stvoreni NO može da dopre do glatkih mišicnih celija, sa toliko mnogo Hb prisutnog u krvi koji brzo reaguje sa NO? Postoji nekoliko mehanizama uklanjanja NO pomocu RBCs koji konkurišu sa slobodnim celijskim Hb i tako onemogucavaju da se NO ponaša kao faktor relaksacije [9]. Hb u RBCs sporije uklanja NO iz krvi nego što bi to ucinio slobodni Hb. Delom, ovo uklanjanje redukovanog NO je bilo pripisano unutrašnjoj membrani RBCs kao barijeri za difuziju NO [10] i specificnim osobinama skeleta proteina vezanih za membranu RBCs sa unutrašnje strane [11]. Brzina uklanjanja NO u RBCs zavisi od hematokritske vrednosti i pritiska kiseonika. Razlikuju se i konstante brzine reakcije NO sa oksidovanim ili dezoksidovanim Hb. Neke studije pokazuju da su promene permeabilnosti 10 i više puta vece u oksigenisanim nego u anoksicnim RBCs. Permeabilnost NO u RBCs u oksigenisanim uslovima je izmeðu 4,400 ìm/s i 5,100 ìm/s, a u dezoksigenisanim uslovima je veca od 64,000 ìm/s [10].

Oba molekula i O2 i NO prolaze u RBC, ali samo O2 difunduje van. U covecjim RBCs derivat Hb, S-nitrozotiol (SNO) (generisan od strane unešenog NO) je povezan vecim delom sa membranom RBC. Transport NO kroz celijsku membranu je omogucen citoplazmatskim domenom hlorid-bikarbonatnog anjonskog–izmenjvaca 1 (AP1) (band 3 protein), koji vezuje Hb. AP1 sadrži dva reaktivna cisteinska ostatka i reakcijom transnitrozilacije razmenjuje NO grupe sa Hb (cysb93). Dalje, celijski mehanizam regulisan kiseonikom, koji objedinjuje sintezu i izlazak NO poreklom iz Hb utice na formiranje AP1-SNO na površini izmeðu membrane i citozola [12]. Postoje studije koje su objavile ulogu Hb kao alostericno regulatorne nitritne reduktaze koja može da posreduje NO-zavisnu signalizaciju duž fiziološkog gradijenta kiseonika. Nitriti (NO2-), reaguju sa dezoksi Hb u jednoj alostericnoj reakciji koja stvara NO i oksiduje dezoksi Hb u metHb. NO onda reaguje, uz ogranicenu brzinu difuzije, sa dezoksi Hb i formira gvožðe-nitrozil-Hb (HbNO), koji je postojan, ali ne kao izvor biodostupnog NO. Meðutim, ispod fizioloških granica saturacije kiseonikom, nitriti ce takoðe reagovati sa oksi Hb. Otkriveno je da dezoksi reakcija tece paralelno sa delimicnom inhibicijom oksi-reakcija [13].

Neke studije pokazuju da HbNO u RBCs može da bude znacajan izvor bioaktivnog NO/nitrita ako je povezan sa ciklusoma askorbinske kiseline (ASC). Pretpostavljeno je da bi ciklus ASC-AFR (ascorbate free radical)-DHA (dehidroaskorbinska kiselina) mogao da bude povezan sa HbNO-nitritom. Mogao bi da ukazuje na mehanizam za endokrini transport NO putem RBCs, rezultujuci produkciju intracelularnog nitrita. Izgleda da su intracelularni nitriti i nitrati vecinom stvoreni nezavisnim putevima u RBCs [14]. U RBCs dolazi do formiranja S-nitrozohemoglobina (SNOHb), koji zadržava NOregulatorne funkcije [15]. S-nitrozilacija hemoglobina je brža kada je hemoglobin u oksi konformaciji, nego u dezoksi konformaciji. Detektovana je veca kolicina SNOHb u arterijskoj krvi nego u venskoj, gde se nalazi više HbNO. U uslovima kada se NO uvodi u biološki sistem gradacijski u limitiranim kolicinama, favorizovana je produkcija SNOHb (više od NO2-) i cak se nitrozilacija hema odigrava prevashodno na â-subjedinicama, što omogucuje dislokaciju NO sa hema do tiola u Hb. Pokazano je da NO reaguje i sa cysb93 ostatkom metHb, pri cemu se stvara S-nitrozomethemoglobin - SNOHb(Fe3+) [15]. Možemo da se zapitamo kakva je uloga, koji su ciljevi i koji je štetniji molekul – metHb ili SNOHb? Objavljeni su rezultati da metHb znacajno umanjuje HbSNO, što navodi da met protein može da igra regulatornu ulogu u smanjenju kolicine slobodnog (ili nevezanog za Hb) nitrita u RBCs što je važno u prevenciji hipotenzije [16].

NO i oksidaciono-antioksidacioni mehanizmi

Eritrociti ne poseduju organele (cak ni funkcionalne mitohondrije u kojima se stvaraju i metabolišu ROS i RNS) vec samo funkcionalnu membranu i citosol ispunjen molekulima hemoglobina. U ovim celijama nema de novo sinteze proteina ili enzima. Eritrociti kao eksperimentalni model predstavljaju bazalni redoks sistem. Izabrani nitro-preparati, odnosno lekovi koji oslobaðaju NO (NO-donori) se razlikuju prema nacinu biotransformacije u celijama, odnosno prema osloboðenoj vrsti azot monoksida. Nitroglicerin (NTG) pripada grupi organskih nitrata i oslobaða NO. nakon enzimatske biotransformacije u celijama [17]. Ukoliko doðe do oksidacionog stresa i oštecenja celija ukljuciuju se komponente antioksidacionog metabolizma u zaštiti celija, ali ako se ovakva odbrana pokaže nedovoljno efikasnom, dolazi do patoloških promena u organizmu što rezultuje nizom oboljenja, ali i starenjem citavog organizma [17]. U ovom oksidaciono-antioksidacionom sistemu ima i NO koji zbog svoje molekulske mase, znacajne hidrofobnosti i jednog nesparenog elektrona prakticno može da proðe kroz bilo koju celiju ili tkivo i da uðe u direktne ili indirektne interakcije sa svim molekulima u/van celije. NO je takoðe izvor i svih RNS što znacajno usložnjava i umrežava biohemijske interakcije ovog molekula [17].

NO može da se aktivira superoksidom ili kiseonikom i formira tako RNS koji dalje izaziva lancane reakcije sa proteinima, lipidima i DNA, koje su odgovorne za celijsku smrt 7 uslovljenu NO. Ove reakcije se odvijaju samo kad su koncentracije NO za duži vremenski period vece od 1μM kao što je blizina aktiviranih leukocita ili drugih celija osetljivih na stimulaciju citokininima ili patološkim produktima. Nitrozacioni stres se dogaða kada se oslobaðaju intermedijeri iz nitrozit tiola, hidroksi i amino grupa. Inicijator nitrozacionog stresa je N2O3 pod fiziološkim uslovima. N2O3 nastaje prvenstveno na neutralnom pH ali i iz NO/O2 reakcije ili iz reakcije NO/O2- kada je fluks NO veci od O2-. U skladu sa ovim kompetitivnim reakcijama nitrozacioni stres se može desiti samo pri jakom lokalizovanom fluksu NO in vivo [18].

Nekontrolisana produkcija NO može da izazove razna oštecenja i bolesti, npr. septicni šok, reumatoidnu i inflamatornu eritropatijui cerebralna oštecenja nakon šoka. Do danas nisu naðena terapeutska sredstva koja bi sanirala ovakve pojave [19]. NO reaguje i sa reaktivnim vrstama pri cemu sam NO ima ulogu antioksidansa. Redukcijom Fe3+ jona, NO inhibira Fentonovu reakciju, cime se sprecava stvaranje najreaktivnije vrste kiseonika – OH. [20]. Zatim, NO reaguje sa višim oksidacionim stanjima hemoproteina (hemoglobin, mioglobin, citohromi – HP+-Fe4+) i vraca ih u pocetno stanje. Na kraju, NO direktno reaguje sa visokoenergetskim reaktivnim vrstama (alkoksil - RO. i alkil hidroperoksil - ROO.) i zaustavlja lancanu reakciju peroksidacije, odnosno proces lipidne peroksidacije [20].

Oksidativni mehanizmi koji dovode do promena celijske membrane, nisu povezani sa aktivacijom stvaranja ONOOH- vec su indukovani cistim NO. On uzrokuje statisticki znacajan porast fluidnosti membrane na razlicitim dubinama lipidnog dvosloja što je povezano sa porastom lipidne peroksidacije. Dešavaju se i znacajne promene u konformacionon statusu proteina citoskeleta. Pretpostavljeno je da se NO ponaša kao prooksidant u koncentracijama za koje se membrana javlja kao prva meta pre ulaska u citozol [21].

NO je poznat kao molekul koji sprecava apoptozu pomocu S-nitrozilacije tiol grupa proteina. NO se generiše i cuva u RBCs, koji mogu pretrpeti eriptozu, suicidalnu celijsku smrt slicnu apoptozi celija sa jedrom. Eriptoza se aktivira porastom citozolne Ca2+ aktivnosti i/ili ceramida i karakteriše se celijskim sabijanjem i izlaganjem fosfatidilserina na površini celije. NO ucestvuje u regulaciji opstanka eritrocita, uticaj je delimicno prikriven cGMP i paralelno se dešava sa promenom nitrozilacije proteina i aktivnosti tireodoksina [22].

EFEKTI NTG NA OKSIDACIONO-ANTIOKSIDACIONI METABOLIZAM RBC

NTG (C3H5N3O9) je bezbojna, uljana, eksplozivna tecnost dobijena nitracijom glicerola [23]. Da bi NTG ostvario svoje efekte, najpre mora biti enzimatski metabolizovan u celijama, pri cemu dolazi do tiol-zavisnog oslobaðanja NO.. Smatra se da nitrati produkuju NO reagujuci sa sulfhidrilnim grupama, ali takoðe se smatra da enzmatsku aktivnost u biotransformaciji NTG mogu imati su i enzimi : glutation S-transferaza, citohrom P450 i ksantin oksidoreduktaza [24]. Meðutim, kasnije je pokazano da su ovi enzimi prvenstveno odgovorni za detoksifikaciju i biotransformaciju organskih nitrata u jetri [17]. Denitrifikacijom NTG-a se produkuje 1,2-gliceril dinitrat (GDN), a NO je katalizovan mitohondrijskom aldehid dehidrogenazom (mtALDH) koja ima centralnu ulogu u bioaktivaciji NTG, vazorelaksaciji i toleranciji [25]. NO je aktivator guanilil ciklaze (GC) u hem-zavisnom mehanizmu. Ova aktivacija rezultuje u formiranju cGMP-a iz GTP-a i tako NO povecava nivo cGMP-a u celiji [23].

NTG i nitrati (NO donori), su korišceni kao terapeutska sredstva u prošlom veku za lecenje vaskularnih bolesti. Pacijenti koji primaju ovakvu terapiju su oni sa anginom pektoris, koronarnom arterijskom bolešcu, hipertenzijom, osteoporozom, poremecajem gastrointestinalnih pokreta, pre-eklampsija, vulvodinija i erektivna disfunkcija kod muškaraca. Nedostatak NO u postmenopauzi se popravlja hormonskom terapijom koja povecava lokalnu produkciju NO. Opadanje lokalne produkcije NO sa sekundarnim smanjenjem estrogena kod žena u postmenopauzi i možda kod starijih muškaraca mogli bi da budu razlog porasta kardiovaskularnih incidenata i seksualnih disfunkcija [19]. Cilj seminarskog rada je da se pokaže metabolizam odreðenih nitropreparata u RBCs.

Dugotrajna upotreba organskih nitrata uzrokuje brzi razvoj nitratne tolerancije smanjujuci hemodinamicku i antiishemicku efikasnost. MtALDH imaju ulogu u aktivaciji organskih nitrata. Mitohondrijske ROS i oksidativna inaktivacija nitratne reduktaze, mtALDH igraju vaznu ulogu u nitratnoj i krostoleranciji. Mada je pokazano i to da u toku hronicnog tretmana nitroglicerinom dolazi do aktivacije membranske NADH-oksidaze u krvnom sudu. Ovaj enzim je stimulisan i angiotenzinom II u kultivisanim glatkomišicnim celijama. NADHoksidaza produkuje znacajne kolicine O2--, koji brzo reaguje sa NO i inaktiviše ga, što može biti razlog nitratne tolerancije [26] Pokazano je da postoji zaštitna uloga organskih nitrata pentaritritil tetranitrat (PETN), koji suprotno organskim nitratima može da reguliše enzime sa snažnim antioksidacionim kapacitetom i tako sprecava toleranciju i razvoj endotelijalne disfunkcije [27]. Efekti nitratne tolerancije su proucavani poslednjih 30-ak godina i došlo se do sledecih hipoteza: 1. Smanjivanje transformacije NTG-a u NO ili NO-vrste 2. Neurohormonska aktivacija koja uzrokuje aktivaciju i otpuštanje vazokonstriktora kao što su endotelin i angiotenzin II, koji neutrališu vazodilataciju indukovanu NTG-om. 3. Povecanje volumena plazme [23]. 4. Oksidacioni stres [28].

Oksidacioni stres uzrokuje u mitohondrijama inaktivaciju mtALDH i to je kljuc za razumevanje transformacije NTG-a za vreme dugotrajnog tretmana i u kulturi celija i kod pacijenata. Ovaj koncept povezuje toleranciju usled oksidacionog stresa sa konceptom nitratne tolerancije. Put bioaktivacije organskih nitrita u krvnim celijama je prikazan na slici 5. Leva strana pokazuje bioaktivaciju visokopotentnih nitrata kao što su NTG, pentaritritil tetranitrat (PETN) i pentaeritritil trinitrat (PETriN) pomocu mitohondrijske aldehid dehidrogenaze mtALDH kada su zastupljene u klinicki znacajnim koncentracijama (<1 ìM). Reduktazna aktivnost prevodi nitrate u nitrite i denitrifikacione metabolite (1,2-gliceril dinitrat [GDN], Slika 4 NTG (1,3-dinitrooxipropan-2-il nitrat); 3 D prikaz i strukturna formula NTG-a

PETriN ili njegove dinitrate PEDN). Nitriti meðutim zahtevaju dalju bioaktivaciju ili redukcijom pomocu respiratornog lanca (citohrom oksidaza [cyt ox]) ili kiselinske disproporcionacije sa unutrašnje strane membrane konacno propuštajuci NO ili srodne vrste (NOx), koje aktiviraju rastvorenu guanilil ciklazu. Rezultujuci porast cGMP ce aktivirati cGMP-zavisnu kinazu I, koja potom uzrokuje vazodilataciju preko nekoliko mehanizama. Desna strana opisuje bioaktivaciju niskopotentnih nitrata kao što su izosorbid dinitrat (ISDN) i izosorbid-5-mononitrat (ISMN) ali isto tako i GDN, PEDN, ali isto tako i doticne mononitrate, gliceril (GMN) and pentaerititil mononitrate (PEMN), pomocu P450 enzim(a) direktno propuštajuci u endoplazmatici retikulumi (ER). Kasniji mehanizmi takoðe ukljucuju visokopotentne nitrate kad su zastupljeni u visokim koncentracijama (>1 ìM) [28].

Autor teksta: Jasmina Milovanović, dipl. biolog

integralna verzija seminarskog rada

Literatura

• [1] GYTON AC, HALL J: Medicinska fiziologija, deveto izdanje 413-419, 1999.
• [2] HALLIWELL B: Lipid peroxidation, antioxidants and cardiovascular disease: How should we

move forward. Cardiovas. Res. 47: 410-418, 2000.

• [3] ŽIKIC RV, ŠTAJN AŠ, SAICIC ZS, SPASIC MB, MILOVANOVIC SR: Toksikološki znacaj

zaštite od oksidacionih oštecenja. Monografija 1-150, 2000.

• [4] HALLIWELL B, GUTTERIDGE JM: Cross CE. Free radicals, antioxidants, and human disease:

where are we now? J Lab Clin Med. 119:598–620, 1992.

• [5] MARKOVIC NA: Lecenje ADRS-a azot monoksidom, VMA Beograd Pdf.
• [6] DAVID RJ, BLAGOJEVIC D, SPASIC, B.M: Molekularna fiziologija 32-39, 2006.
• [7] KLEINBORGARD P, SCHULZ R, RASSAF T, THOMAS T, DEJAM A, JAX T, et al.: Red

blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood 107 (7): 2943-2951, 2006.

• [8] COKIC VP, SCHECHTER AN: Effects of nitric oxide on red blood cell development and

phenotype. Curr Top Dev Biol. 82: 169-215, 2008.

• [9] HAN TH, LIAO JC: Erythrocyte nitric oxide transport reduced by a submembrane cytoskeletal

barrier. Biochim Biophys Acta 1723:135–142, 2005.

• [10] HUANG TK., HUANG Z AND KIM-SHAPIRO BD: Nitric Oxide Red Blood Cell Membrane

Permeability at high and low Oxygen Tension. Nitric okside. 16(2): 209-216, 2007.

• [11] HUANG TK, HAN TH, HYDUKE DR, VAUGHN MW, HERLE HV, HEIN, TW: Modulation

of nitric oxide bioavailability by erythrocytes. Proc Natl Acad Sci USA 98: 11771-11776, 2007.

• [12] PAWLOSKI JR, HESS DT, STAMLER JS,: Export by red blood cells of nitric oxide bioactivity.

Nature 409(6820): 577-8, 2001.

• [13] GRUBINA R, HUANG Z, SHIVA S, JOSHI MS, AZAROV I, BASU S: Concerted Nitric Oxide

Formation and Release from the Simultaneous Reactions of Nitrite with Deoxy- and Oxyhemoglobin J. Biol. Chem. 282(17): 12916-12927, 2007.

• [14] SIBMO N, PIKNOVA B, RIZZATTI F, SCHECHTER AN: Oxidation of iron-nitrosylhemoglobin

by dehydroascorbic acid releases nitric oxide to form nitrite in human erythrocytes. Biochemistry. 47(9): 2989-96, 2008.

• [15] LUCHSINGER BP, RICH EN, GOW AJ, WILLIAMS EM, STAMLER JS: Routes to S-nitrosohemoglobin

formation with heme redox and preferential reactivity in the â subunits. Proc Natl Acad Sci USA 100: 461-466, 2003.

• [16] LATERREUR J: Hemoglobin S-nitrosation on oxygenation of nitrite/deoxyhemoglobin

incubations is attenuated by methemoglobin. J Inorg Biochem. 101(11-12):1827-35, 2007.

• [17] MALETIC SD: Efekti nitro preparata na oksidaciono-antrioksidacioni metabolizam crvenih

krvnih celija pacova. Doktorska disertacija, 2004.

• [18] WINK DA, KATRINA M MIRANDA AND ESPEY M G: Cytotoxicity Related to Oxidative

and Nitrosative Stress by Nitric Oxide. Symposia. Radiation Biology Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD, 20892

• [19] WIMALAWANSA SJ: Nitric oxide: new evidence for novel therapeutic indications. Expert Opin

Pharmacother. 9 (11): 1935-54, 2008.

• [20] RUBBO H, RADI R, TRUJILLO M, TELLERI R, KALYANARAMAN B, BARNES S: Nitric

oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation. Formation of novel nitrogen-containing oxidized lipid derivatives. J Biol Chem 269: 26066-26075, 1994.

• [21] BRZESZCZYNSKA J, GWOZDZINSKI K: Nitric oxide induced oxidative changes in

erythrocyte membrane components.Cell Biol Int. 32(1): 114-20, 2008.

• [22] NICOLAY JP, LIEBIG G, NIEMOELLER OM, KOKA S, GHASHGHAEINIA M, WIEDER T,

HAENDELER J, BUSSE R, LANG F: Inhibition of suicidal erythrocyte death by nitric oxide. Pflugers Arch. 456(2): 293-305, 2008.

• [23] Podaci su preuzeti iz Wikipedije.Wikipedia®
• [24] MC GUIRE JJ, ANDERSON DJ, MCDONALD BJ, NARAYANASAMI R, BENNETT BM:

Inhibition of NADPH-cytochrome P450 reductase and glyceryl trinitrate biotransformation by diphenyleneiodonium sulfate. Biochem Pharmacol 56: 881-893, 1996.

• [25] CHEN Z, ZHANG J, STAMLER JS: Identification of the enzymatic mechanism of nitroglycerin

bioactivation. Proc Natl Acad Sci USA 99: 8306-8311, 2002.

• [26] HARRISON DG, KURZ S, TARPEY M, FREEMAN B, MÜNZEL TH: Increased vascular

superoxide production: a novel mechanism underlying nitrate tolerance. In: Münzel Th, Harrison DG, Just H, eds. Nitrates in Cardiovascular Disease. Basic Mechanisms of Action, Tolerance Phenomena, Clinical Applications. Verlag, Broken: Medizin & Wissenschaft. 53-56, 1996.

• [27] DAIBER A, WENZEL P, OELZE M, MÜNZEL T: New insights into bioactivation of organic

nitrates, nitrate tolerance and cross-tolerance. Clin Res Cardiol. 97(1): 12-20, 2008.

• [28] MUNZEL T, SAYEGH H, FREEMAN BA, TARPEY MM, HARRISON DG: Evidence for

enhanced vascular superoxide anion production in nitrate tolerance. A novel mechanism underlying tolerance and cross-tolerance. J Clin Invest 95 187–194, 1995.

• [29] WINK DA, MITCHELL JB: Chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory,

cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radic Biol Med: 25: 434-456, 1998.

• [30] DI FABIO J, JI Y, VASILIOU V, THATCHER G R, BRNNETT B: Role of mitochondrial

aldehyde dehydrogenase in nitrate tolerance. Mol Pharmacol 64:1109-1116, 2003.

• [31] ROMERO N, RADI R, LINARES E, AUGUSTO O, DETWEILER CD, MASON RP,

DENICOLAS A: Reaction of human hemoglobin with peroxynitrite. Isomerization to nitrate and secondary formation of protein radicals. J Biol Chem 278: 44049-44057, 2003.

• [32] ARESE P, DE FLORA A: Pathophysiology of hemolysis in glucose-6-phosphate dehydrogenase

deficiency. Semin Hematol 27: 1-40, 1990.

• [33] MALETIC SD, DRAGICEVIC-ÐOKOVIC LJM, ŽIKIC RV, ŠTAJN AŠ, MILENKOVIC P,

KOSTIC MM: Effects of nitric oxide donors on energy metabolism of rat erythrocytes. J Environ Pathol Toxicol Oncol 19: 383-390, 2000.

• [34] BROWN KE, KNUDSEN CA: Oxidized heme proteins in an animal model of hemochromatosis.

Free Radic Biol Med: 24: 239-244, 1998.

• [35] KOZLOV VA, DIETRICH B, NOHL H: Various intracellular compartments cooperate in the

release of nitric oxide from glycerol trinitrate in liver. British Journal of Pharmacology 139: 989–997, 2003.

• [36] MARKOVIC SD, OGNJANOVIC BI, STAJN AS, ZIKIC RV, SAICIC ZS, RADOJICIC RM,

SPASIC MB: The effects of nitroglycerine on the redox status of rat erythrocytes and reticulocytes. Physiological research 55(4): 389-396, 2006

• [37] POGOSYAN AS, VENEDIKTOVA NI, KOSENKO EA, KAMINSKII YG: Antioxidant status

of erythrocytes after acupuncture treatment. Bull Exp Biol Med. 138(1): 26-9, 2004.

• [38] MÜNZEL T, WENZEL P AND DAIBER A: Do We Still Need Organic Nitrates? Journal of the

American College of Cardiology: 49(12): 1296-1298, 2007.

• [39] GIBBONS RJ, ABRAMS J AND CHATTERJEE K et al.: ACC/AHA 2002 guideline update for

the management of patients with chronic stable angina—summary article: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee on the Management of Patients With Chronic Stable Angina). J Am Coll Cardiol 41: 159–168, 2003.