Intracelularna kontrola ćelijske proliferacije

Seminarski rad 

Uvod

Veličina jedinke zavisi pre svega od ukupnog broja ćelija. Kod odraslog čoveka, taj broj približno iznosi oko 100 biliona ćelija, ili u proseku oko 1 milijardu ćelija po gramu tkiva. U svim višećelijskim organizmima tokom čitavog života odvija se kontinuirano stvaranje novih ćelija i uklanjanje ostarelih, a stalnost ukupnog broja ćelija odraslih jediniki predstavlja rezultat finog balansa između ćelijske proliferacije (mitoze) i apoptoze tj. ćelijske smrti (Bumbaširević, 2004).

Deoba ćelije obezbeđuje da novonastale ćerke ćelije dobiju podjednaku količinu DNK, a i u većini slučajeva približno podjednaku količinu citoplazme sa organelama i molekulima. Ćelijski ciklus obuhvata vreme i događaje koji se odvijaju između dve ćelijske deobe, uključujući i samu ćelijsku deobu. Njegova dužina zavisi od vrste i može da traje od 1,5 - 2 sata kod ćelija kvasca koje rastu, do nekoliko godina kod ćelija jetre čoveka. Međutim, minimalno vreme ćelijskog ciklusa za ćelije čoveka iznosi oko 24 sata.

Tradicionalno se ćelijski ciklus deli u četiri stadijuma ili faze: M, G1, S i G2 (slika 1). U toku M faze (mitoze), odigravaju se mikroskopom najuočljiviji događaji, kada se vrši podela jedrovog materijala – kariokineza, i podela ćelije – citokineza. Ovo je ujedno i najkraća faza ciklusa i kod tipične ćelije sisara traje oko jednog sata. Ostali period između dve M faze ćelijskog ciklusa naziva se interfaza. Iako se pomoću mikroskopa ne uočavaju neke značajnije promene izuzev uvećanja ćelijske mase, tokom interfaze se dešavaju mnogobrojni događaji tokom kojih se ćelija priprema za deobu i sastoji se iz preostale 3 faze ćelijskog ciklusa: G1, S i G2 faze.

Slika 1 Faze ćelijskog ciklusa

Tokom S faze (S=sinteza), odvija se replikacija, odnosno sinteza nukleusne (jedarne) DNK. G1 faza (G=gap, pukotina engl.) je interval između završene mitoze (M faze) i početka S faze, dok je G2 faza interval između S faze i početka M faze. Tokom čitave interfaze, u ćeliji se odvija transkripcija gena i sinteza proteina neophodnih za uvećanje ćelijske mase, kao i za kontrolu i odvijanje ćelijskog ciklusa. G1 i G2 faza omogućavaju dodatno vreme ćeliji da uveća svoju masu i udvostruči količinu ćelijskih organela, da bi posle deobe, ćerke ćelije imale odgovarajuću količinu organela i ćelijsku masu. Kada bi interfaza trajala samo onoliko koliko je potrebno ćeliji da izvrši replikaciju DNK, ćelija ne bi imala vremena da udvostruči svoju masu, pa bi posle svake deobe ćelije postajale progresivno sve manje i manje. To se zaista i dešava u posebnim okolnostima. Naime, u toku prvih nekoliko deoba oplođene jajne ćelije (brazdanje jajne ćelije) dolazi do progresivnog smanjenja novonastalih ćelija. U toku ovih ćelijskih ciklusa, G1 i G2 faza su drastično skraćene i praktično ne postoje. Ćelijski ciklus je veoma organizovan i složen proces, koji obezbeđuje kompletnu i preciznu replikaciju DNK i ćelijskih komponenti pre deobe. U toku ovog procesa učestvuje čitav niz molekula, enzima uključenih u proizvodnju novih ćelijskih komponenti (DNK, membrane organela, itd.). Pored ove proizvodne mašinerije, postoje i molekuli koji učestvuju u kontroli ćelijskog ciklusa, tzv. kontrolni sistem ćelijskog ciklusa. Ovaj sistem obezbeđuje pravilnost u napredovanju ćelijskog ciklusa, sprečavajući napredovanje ukoliko u određenoj fazi ciklusa nisu stekli svi neophodni uslovi za prelazak u sledeću fazu. Za jedan višećelijski organizam veoma je važno da se ćelije dele kada je to potrebno i u onolikoj meri koliko je to potrebno. Nedovoljno ili prekomerno deljenje ćelija može da dovede do ozbiljnih poremećaja u normalnom funkcionisanju organizma (Bumbaširević, 2004).

Za odvijanje ćelijskog ciklusa najvažnije su tri grupe proteina:

• Ciklin-zavisne kinaze (CDK, cyclin dependent kinases)su enzimi koji vrše fosforilaciju (dodavanje fosfatnih grupa na specifične aminokiseline u proteinima) određenih ključnih proteina, pa ih tako najčešće aktiviraju.
• Ciklini su proteini koji kada su prisutni u dovoljnom broju aktiviraju CDK (slika 2).
• Inhibitori ciklin-zavisnih kinaza (CKI)kada su prisutni u dovoljnoj koncentraciji sprečavaju aktivnost ciklin-Cdk.

Slika 2 Ciklin-CDK kompleks

S-faza

Inicijacija DNA replikacije pomoću Ciklin-Cdk kompleksa (S-Cdk)

Ćelija mora da kontoliše inicijaciju i samu DNA replikaciju. Replikacija mora da se odvija sa ekstremnom tačnošću da bi se rizik od mutacija sveo na minimum. Prve informacije o regulaciji S faze su dobijene iz eksperimenata gde su dve ćelije fuzionisane u različitim fazama ciklusa (slika 3).

Slika 3 Prikaz eksperimenta o dokazivanju prisustva S-Cdk u ćelijama S-faze

• A - Kada se G1 ćelija spoji sa ćelijom koja je u S fazi, DNA replikacija se javlja u nukleusu G1 ćelije (najverovatnije izazvano prisustvom S-Cdk u ćeliji S faze).
• B - Fuzija G2 ćelije i ćelije u S fazi ne izaziva sintezu DNA u G2 nukleusu.
• C - Fuzija G1 i G2 ćelije ne izaziva nagli prelaz G1 ćelije u S fazu. To pokazuje da citoplazmatični faktori odgovorni za DNA replikaciju u S fazi, nestaju kada ćelija uđe u G2 fazu. U slučaju ove fuzije, G1 ćelija će ući u S fazu prateći signale iz svoje ćelije.

U ćelijama koje su u G1 fazi moguće je inicirati replikaciju DNA, dok u ćelijama koje su u G2 fazi nije moguće inicirati replikaciju DNA prisustvom aktivatora iz ćelije u S fazi. Očigledno, prolaz kroz mitozu je nepohodan da bi ćelija povratila sposobnost replikacije DNA.

Replikacija započinje u interakciji inicijatora i replikatora. Pod replikatorom podrazumevamo set sekvenci DNK koje su neophodne za inicijaciju replikacije i u okviru replikatora se nalazi i samo mesto početka replikacije. Vrlo važan momenat u replikaciji eukariota je činjenica da se svi replikoni ne “pale“ istovremeno. To je zapaženo odavno kod kvasca koji ima nekoliko stotina replikona, da postoje setovi replikona koji se sukcesivno uključuju, dakle replikacija ne započinje istovremeno na svim replikatorima.

Inicijator je protein ili kompleks proteina koji se vezuju za replikator, specificno prepoznaju određene nukleotidne sekvence i omogućavaju da replikacija započne. Kod eukariota je inicijator tzv. origin recognation complex, ORC. On se sastoji od 6 proteina, vezuje ATP, prepoznaje replikator i regrutuje druge regulatorne proteine za replikaciju.

Jedan od regulatornih proteina je Cdc6. Nivo ovog proteina je nizak tokom većine ćelijskog ciklusa. Njegova količina se povećava u ranoj G1 fazi. On se vezuje za ORC u ranoj G1 fazi i zajedno sa Mcm proteinima gradi proteinski prereplikativni kompleks, ili pre-RC. Prereplikativni kompleks se aktivira fosforilacijom proteina kompleksa ciklin zavisnom kinazom, S-Cdk (slika 4).

Slika 4 Stvaranje prereplikativnog kompleksa i inicijacija replikacije uz pomoć S-Cdk

S-Cdk su vrlo vazne za regulaciju inicijacije replikacije, tj. one određuju kada će neki replikator da bude aktivan, jer se aktivnost ovih kinaza u toku ćelijskog ciklusa menja. Ako dođe do aktivacije pre-RC ciklin zavisnim kinazama, onda će doći i do vezivanja DNK polimeraza. Početak S faze je početak replikacije. Najvažniji mehanizam regulacije replikacije je uz pomoc S-Cdk. Njihova aktivnost je u G1 fazi niska, i tada moze da dođe do formiranja prereplikativnog kompleksa, ali ne moze da dođe do njegove aktivacije. U S fazi aktivnost S-Cdk je visoka, i tada ne moze doci do formiranja novih prereplikativnih kompleksa (jer bi se i oni aktivirali i doslo bi do ponovnog zapocinjanja replikacije u jednoj istoj S fazi), ali dolazi do aktivacije postojećih (fosforilacijom). Znači od aktivnosti kinaza, koja je posebno regulisana, zavisi da li će replikacija početi, to je veoma složen proces (http://www.biolozi.net/upload/OMB-6.pdf).

Kada je pre-RC komleks sastavljen u G1 fazi replikacija može početi. Aktivacija S-Cdk u kasnoj G1 fazi inicira replikaciju. Inicijacija replikacije takođe zahteva aktivnost druge protein kinaze , koja sarađuje sa S-Cdk i izaziva fosforilaciju ORC kompleksa.

S-Cdk ne inicira samo replikaciju, on i sprečava replikaciju na nekoliko načina. Prvo, omogućava disocijaciju Cdc6 od ORC nakon početka replikacije, rastavlja se pre-RC kompleks i tako se sprečava ponavljanje replikacije na istom mestu. Drugo, sprečava ponovno okupljanje Cdc6 i Mcm proteina na začetku replikacije. S-Cdk fosforiliše Cdc6 protein koji nije vezan za početak replikacije i na taj način Cdc6 degradira u proteozome. S-Cdk fosforiliše neke Mcm proteine, aktivira njihov izlazak iz jedra i omogućava da ovaj kompleks ne može da se vezuje za početak replikacije.

S-Cdk aktivnost ostaje na visokom nivou tokom G2 faze i na početku mitoze, sprečavajući replikaciju nakon završene S faze. M-Cdk takođe sprečava replikaciju tokom mitoze tako što fosforiliše Cdc6 i Mcm proteine.

Dakle, nekoliko Ciklin-Cdk kompleksa sarađuje i onemogućava rano stvaranje pre-RC kompleksa i sprečava replikaciju nakon S faze. Na kraju mitoze količina celokupne Cdk aktivnosti je svedena na nulu. Defosforilacijom Cdc6 i Mcm omogućava se stvaranje pre-RC kompleksa i ponovna replikacija tokom narednog ciklusa.

G2 faza

G2 kontrolna tačka - Nekompletna DNA replikacija blokira ulaz u mitozu

Ukoliko bi ćelija ušla u mitozu pre završene replikacije DNA, ćerke ćelije bi nakon deobe imale nepotpun set hromozoma. Ovo je izbegnuto u većini ćelija mehanizmom kontrolnih tačaka, koji omogućava da mitoza ne može početi sve dok se poslednji nukleotid ne iskopira. Senzorni mehanizmi, nepoznate molekularne prirode detektuju nerepliciranu DNA ili odgovarajuću nezavršenu replikacionu viljušku i šalju negativan signal sistemu za kontrolu ćelijskog ciklusa čime blokiraju aktivaciju M-Cdk enzima. Negativni signal kontrolne tačke aktivira protein kinazu koja inhibira Cdc25 protein fosfatazu (slike 6 i 7). Kao rezultat M-Cdk ostaje fosforilisana i neaktivna sve dok se ne završi replikacija DNA.

Da bi se pokazalo prisustvo kontrolne tačke, urađen je eksperiment (Slika 5). Ćelije sisara u kulturi su tretirane sa kofeinom, hidroksiureom i kofeinom i hidroksiureom zajedno. Hidroksiurea je hemijski inhibitor sinteze DNA, dok velike doze kofeina inhibiraju mehanizam kontolnih tačaka. Netretirane ćelije, postavljene kao kontrola, prolaze kroz ćelijski ciklus bez smetnji i rezultat je normalna mitoza. Ćelije tretirane kofeinom, takođe završavaju ćelijski ciklus uspešnom mitozom. Ćelije tretirane hemijskim ihnibitorima DNA sinteze kao sto su hidroksiurea ne vrše progres u mitozu, ćelijski ciklus zastaje u S fazi. DNA molekula je nereliplicirana, što aktivira mehanizam kontrolne tačke, koji zaustavlja ćelijski ciklus u S fazi i onemogućava ulazak u M fazu. Ukoliko je mehanizam kontrolnih tačaka neispravan, kao u ćelijama kvasca sa određenim mutacijama ili u ćelijama sisara koje su tretirane visokim dozama kofeina, ćelije ulaze u mitozu iako je DNA replikacija nezavršena, jer je kofein ihnibirao aktivnost kontrolne tačke, i to ze završava smrću ćerki ćelija.

Slika 5 Prikaz eksperimenta za dokazivanje prisustva kontrolne tačke

M-faza

Aktivacija M-faze – Ciklin Cdk kompleks (M-Cdk) kao okidač za ulazak u mitozu

U G2 fazi, ćelija ima udvostručenu DNA i priprema se za mitozu. Aktivacija M-Cdk počinje akumulacijom M-ciklina. U embrionalnim ćelijama sinteza M-ciklina je konstantna tokom ćelijskog ciklusa, a njegova količina se reguliše većom ili manjom degradacijom. Akumulacija M-ciklina je rezultat smanjene degradacije. U većini tipova ćelija sinteza M-ciklina se povećava tokom G2 i M faze, povećanom transkripcijom gena za M-ciklin. Što je ćelija bliža M fazi, koncentracija M–Cdk (kompleksa Cdk1 i M-ciklina) je veća. Aktivnost M-Cdk je potisnuta kada Wee1 kinaza fosforiliše dva specifična mesta (zbog jednostavnosti na slici je prikazano jedno mesto) na Cdk molekulu, koji se nalaze iznad aktivacijskog mesta (Slika 5).

Slika 6 Regulacija aktivnosti Cdk

Ključni događaj u aktivaciji M-Cdk je uklanjanje inhibitornih fosfata od strane fosfataze Cdc25, na kraju G2 faze (Slika 6) (Alena Buretić-Tomljanović, 2006).

Dve protein kinaze aktiviraju Cdc25, jedna poznata kao Polo kinaza, a druga je sama M-Cdk. M-Cdk takođe fosforiliše i inhibira Wee1 što obezbeđuje naglo povećanje aktivnosti M-Cdk.

Slika 7 Aktivacija M-Cdk

Sposobnost M-Cdk da aktivira sopstvenog aktivatora (Cdc25) i inhibira svog inhibitora (Wee1) pokazuje da je aktivacija M-Cdk pozitivna povratna sprega. Parcijalna aktivacija Cdc25, npr. pomoću Polo kinaze, dovodi do delimične aktivacije dela M-Cdk kompleksa, koji tada fosforiliše više Cdc25 i Wee1 molekula. Ovo dovodi do više M-Cdk defosforilizacije i aktivacije. Takav mehanizam brzo aktivira sve M-Cdk komplekse u ćeliji i omogućava nagli porast M-Cdk aktivnosti.

Aktivnost i uticaj M-Cdk na na ćelijski ciklus

Jedna od najznačajnijih karakteristika kontrole ćelijskog ciklusa je da protein kinaza, M-Cdk, odgovorna za većinu raznolikih i složenih preuređenja koja se pojavljuju u ranim fazama mitoze. U najmanje M-Cdk mora da pokrene spajanje mitotičkog vretena i mora da osigura da se duplicirani hromozomi zakače na vreteno. Kod mnogih organizama M-Cdk je takođe okidač za kondenzaciju hromozoma, pucanje jedrovog omotača i preuređivanje aktin citoskeleta, kao i za reorganizaciju Goldži aparata i endoplazmatičnog retikuluma.

Direktna fosforilacija laminskih filamenata koji daju strukturu jedrovom omataču, od strane M-Cdk je prvi korak u raspadu jedrovog omotača.

Kompleks od 5 proteina-kondensin complex-Xenopus embriona su zaduženi za kondenzaciju hromozoma. M-Cdk fosforiliše nekoliko subjedinica nakon čega ovaj kompleks kondenzuje hromozome. Za svaki od ovih događaja se misli da se pokreću kada M-Cdk fosforiliše određene strukturne i regulatorne proteine koji su uključeni u događaj. Većina ovih proteina nije identifikovana.

Razdvajanje sestrinskih hromatida

Slika 8 Kaskadni mehanizam razdvajanja sestrinskih hromatida

Nakon što je M-Cdk izazvao niz preraspodela koje uvode ćeliju u ranu mitozu, ćelijski ciklus dostiže svoju kulminaciju sa razdvajanjem sestrinskih hromatida u periodu prelaska metafaze u anafazu. APC (anaphase-promoting complex) inicira razdvajanje hromatida. APC je visoko regulisana ubikvitin ligaza koja izaziva destrukciju nekliko mitotskih regulatornih proteina.

Sestre hromatide su vezane uz pomoć kompleksa proteina - kohezin kompleksa. Kohezin je blisko povezan sa proteinima kondenzin kompleksa koji su uključeni u kondenzaciju hromozoma, što ukazuje na zajedničko evolutivno poreklo.

Anafaza počinje sa naglim raskidom veze između sestrinskih hromatida, i one se postavljaju na suprotne polove deobnog vretena. Ovaj proces je iniciran kaskadnim mehanizmom. Razlaganje sestrinskih hromatida zaheva aktivaciju APC enzimskog kompleksa, sa proteolizom koja je glavna u ovom procesu.

Cilj APC-a je protein securing. Pre anafaze, securing se vezuje i inhibira aktivnost proteaze – separaze. Destrukcija securina na kraju metafaze oslobađa separazu, koja se zatim lepi za subjedinicu kohezin kompleksa i dolazi do naglog razdvajanja sestrinskih hromatida (Slika 8).

APC aktivira anafazu, a šta aktivira APC? Mehanizam aktiviranja APC je delimično poznat. APC aktivacija zahteva protein Cdc20 proteina koji se vezuje za APC i aktivira je u mitozi (Slika 8).

Najmanje dva procesa regulišu Cdc20 i njegovu asocijaciju sa APC. Prvo Cdc20 sinteza se povećava kako se ćelija približava mitozi, zbog povećane transkripcije, drugo, fosforilacija APC pomaže Cdc20 da se veže za APC, i pomaže da se stvori aktivni kompleks. Nije poznato koja kinaza fosforiliše i aktivira Cdc20-APC kompleks. Prisustvo M-Cdk je neophodno za aktivnost ove kinaze, ali postoji značajno kašnjenje u aktivaciji M-Cdk i aktivaciji Cdc20-APC kompleksa. Molelukarne osnove ovog kašnjenja su još uvek nepoznate.

Metafazna kontrolna tačka

Ćelija se ne ulazi u anafazu pre nego što je potpuno pripremljena za razdvajanje hromatida. U većini ćelijskih tipova postoji mehanizam metafazne kontrolne tačke koja operira tokom mitoze da bi osigurala da su svi hromozomi pravilno zakačeni za deobno vreteno pre nego što počne odvajanje sestrinske hromatide. Kontrolna tačka zavisi od mehanizma senzora koji nadgledaju stanje kinetohore, specijalizovane regije hromozoma koja se kači na mikrotubule deobnog vretena. Svaka kinetohora koja nije pravilno zakačena šalje negativan signal sistemu za kontrolu ćelijskog ciklusa čime se blokira aktivacija Cdc20-APC, a time i odvajanje sestrinske hromatide.

Slika 9 Mad2 protein na nezakačenoj kinetofori

Priroda signala koji generiše nezakačena kinetohora nije baš najjasnija. Nekoliko proteina, među kojima je i Mad2, se angažuju u metafaznoj kontrolnoj tački. Makar i jedna nezakačena kinetohora rezultuje tome da se Mad2 veže za Cdc20-APC inaktivira Cdc20-APC kompleks i spreči degradaciju securina i rezdvajanje sestrinskih hromatida (slika 9). Dakle, nije moguće razdvajanje sestrinskih hromatida sve dok se i poslednja kinetohora ne zakači za deobno vreteno.

Na slici 9 je pokazano prisustvo kinetohore i Mad2 proteina na ćeliji sisara u prometafazi. Deobno vreteno je zelene boje, sestrinske hromatide su plave. Jedan par sestrinskih hromatida nije zakačen za deobno vreteno. Prisustvo Mad2 na kinetofori je prikazano antitelom anti-Mad2 koje se vezalo za Mad2 – crvena tačka označena crvenom strelicom. Drugi par sestrinskih hromatida se kači na debno vreteno i kinetofora ove hromatide ima nizak nivo Mad2 – prikazano bledom tačkom označeno belom strelom. Ono što iznenađuje jeste da normalno tempirana anafaza ne zahteva funkcionalnu metafaznu kontrolnu kod žaba i kvasaca. Mutirane ćelije kvasca sa oštećenom kontrolnom tačkom prolaze kroz anafazu u nekom normalnom vremenu, dok neki drugi mehanizam detektuje vreme anafaze u ovim ćelijama. Kod ćelija sisara, mutirana metafazna kontrolna tačka utiče na anafazu da se okine ranije nego što je to uobičajeno. Ovaj nalaz ukazuje na to da je kontrolna tačka, u ljudskim ćelijama, evoluirala iz pomoćne u neophodnu komponentu kontrole ćelijskog ciklusa.

Izlazak iz mitoze zahteva inaktivaciju M-Cdk

Nakon što su hromozomi podeljeni na polove deobnog vretena, ćelija mora da eliminiše složene promene iz rane mitoze. Vreteno mora biti rastavljeno, hromozomi rekondenzovani, a jedro obnovljeno. Kao što je fosforilacija raznih proteina potrebna da bi se ćelije uvele u mitozu, tako je defosforilacija potrebna da bi ćelije izvele iz rane mitoze. U principu, defosforilacija se može pokrenuti bilo deaktivacijom M-Cdk, bilo aktivacijom fosfataza, ili koršićenjem oba načina. U najčešćem slučaju je ovo prvo. Deaktivacija M-Cdk se najčešće vrši ubikvitilacijom M-ciklina. Ubikvitilacija ciklina se najčešće okida istim Cdc20-APC kompleksom koji utiče na uništenje securina u tranziciji između metafaze i anafaze (slika 10).

Slika 10 Deaktivacija M-Cdk pomoću Cdc20-APC kompleksa

Stoga, aktivacija Cdc20-APC kompleksa ne utiče samo na prelaz u anafazu, već utiče i na deaktivaciju M-Cdk, koja dalje utiče na sve procese i događaje koji ćeliju izvode iz mitoze.

• videti nastavak
  

Za više podataka pogledati Intracelularna kontrola ćelijske proliferacije - II deo

Literatura

osnovna literatura:

• Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter (2007): Molecular Biology of the Cell - Fifth Edition - Garland Science

dopunska literatura:

• Alena Buretić-Tomljanović (2006): Regulacija staničnog ciklusa. http://www.medri.hr/katedre/Biologija/mld/biologija/Regulacija%20stanicnog%20ciklusa.pdf

• http://www.biolozi.net/upload/OMB-6.pdf

• http://www.pbf.hr/hr/content/download/8468/43134/version/1/file/Regulacija+stanicnog+ciklusa.pdf

• Ivan-Krešimir Svetec (2009): Regulacija staničnog ciklusa. Laboratorij za biologiju i genetiku mikroorganizama.

• Vladimir Bumbaširević (2005): Ćelijski ciklus. Institut za Histologiju i embriologiju. www.med.bg.ac.rs/dloads/.../Vladimir%20Bumbasirevic%20BMR2004.pdf

• www.medri.hr/katedre/Biologija/dsi/biologija/STANICNI_CIKLUS.ppt

Jelena Ačanski