Intracelularna kontrola ćelijske proliferacije

Uvod

Veličina jedinke zavisi pre svega od ukupnog broja ćelija. Kod odraslog čoveka, taj broj približno iznosi oko 100 biliona ćelija, ili u proseku oko 1 milijardu ćelija po gramu tkiva. U svim višećelijskim organizmima tokom čitavog života odvija se kontinuirano stvaranje novih ćelija i uklanjanje ostarelih, a stalnost ukupnog broja ćelija odraslih jediniki predstavlja rezultat finog balansa između ćelijske proliferacije (mitoze) i apoptoze tj. ćelijske smrti (Bumbaširević, 2004).

Deoba ćelije obezbeđuje da novonastale ćerke ćelije dobiju podjednaku količinu DNK, a i u većini slučajeva približno podjednaku količinu citoplazme sa organelama i molekulima. Ćelijski ciklus obuhvata vreme i događaje koji se odvijaju između dve ćelijske deobe, uključujući i samu ćelijsku deobu. Njegova dužina zavisi od vrste i može da traje od 1,5 - 2 sata kod ćelija kvasca koje rastu, do nekoliko godina kod ćelija jetre čoveka. Međutim, minimalno vreme ćelijskog ciklusa za ćelije čoveka iznosi oko 24 sata.

Tradicionalno se ćelijski ciklus deli u četiri stadijuma ili faze: M, G1, S i G2 (slika 1). U toku M faze (mitoze), odigravaju se mikroskopom najuočljiviji događaji, kada se vrši podela jedrovog materijala – kariokineza, i podela ćelije – citokineza. Ovo je ujedno i najkraća faza ciklusa i kod tipične ćelije sisara traje oko jednog sata. Ostali period između dve M faze ćelijskog ciklusa naziva se interfaza. Iako se pomoću mikroskopa ne uočavaju neke značajnije promene izuzev uvećanja ćelijske mase, tokom interfaze se dešavaju mnogobrojni događaji tokom kojih se ćelija priprema za deobu i sastoji se iz preostale 3 faze ćelijskog ciklusa: G1, S i G2 faze.

Slika 1 Faze ćelijskog ciklusa

Tokom S faze (S=sinteza), odvija se replikacija, odnosno sinteza nukleusne (jedarne) DNK. G1 faza (G=gap, pukotina engl.) je interval između završene mitoze (M faze) i početka S faze, dok je G2 faza interval između S faze i početka M faze. Tokom čitave interfaze, u ćeliji se odvija transkripcija gena i sinteza proteina neophodnih za uvećanje ćelijske mase, kao i za kontrolu i odvijanje ćelijskog ciklusa. G1 i G2 faza omogućavaju dodatno vreme ćeliji da uveća svoju masu i udvostruči količinu ćelijskih organela, da bi posle deobe, ćerke ćelije imale odgovarajuću količinu organela i ćelijsku masu. Kada bi interfaza trajala samo onoliko koliko je potrebno ćeliji da izvrši replikaciju DNK, ćelija ne bi imala vremena da udvostruči svoju masu, pa bi posle svake deobe ćelije postajale progresivno sve manje i manje. To se zaista i dešava u posebnim okolnostima. Naime, u toku prvih nekoliko deoba oplođene jajne ćelije (brazdanje jajne ćelije) dolazi do progresivnog smanjenja novonastalih ćelija. U toku ovih ćelijskih ciklusa, G1 i G2 faza su drastično skraćene i praktično ne postoje. Ćelijski ciklus je veoma organizovan i složen proces, koji obezbeđuje kompletnu i preciznu replikaciju DNK i ćelijskih komponenti pre deobe. U toku ovog procesa učestvuje čitav niz molekula, enzima uključenih u proizvodnju novih ćelijskih komponenti (DNK, membrane organela, itd.). Pored ove proizvodne mašinerije, postoje i molekuli koji učestvuju u kontroli ćelijskog ciklusa, tzv. kontrolni sistem ćelijskog ciklusa. Ovaj sistem obezbeđuje pravilnost u napredovanju ćelijskog ciklusa, sprečavajući napredovanje ukoliko u određenoj fazi ciklusa nisu stekli svi neophodni uslovi za prelazak u sledeću fazu. Za jedan višećelijski organizam veoma je važno da se ćelije dele kada je to potrebno i u onolikoj meri koliko je to potrebno. Nedovoljno ili prekomerno deljenje ćelija može da dovede do ozbiljnih poremećaja u normalnom funkcionisanju organizma (Bumbaširević, 2004).

Za odvijanje ćelijskog ciklusa najvažnije su tri grupe proteina:

• Ciklin-zavisne kinaze (CDK, cyclin dependent kinases)su enzimi koji vrše fosforilaciju (dodavanje fosfatnih grupa na specifične aminokiseline u proteinima) određenih ključnih proteina, pa ih tako najčešće aktiviraju.
• Ciklini su proteini koji kada su prisutni u dovoljnom broju aktiviraju CDK (slika 2).
• Inhibitori ciklin-zavisnih kinaza (CKI)kada su prisutni u dovoljnoj koncentraciji sprečavaju aktivnost ciklin-Cdk.

Slika 2 Ciklin-CDK kompleks

S-faza

Inicijacija DNA replikacije pomoću Ciklin-Cdk kompleksa (S-Cdk)

Ćelija mora da kontoliše inicijaciju i samu DNA replikaciju. Replikacija mora da se odvija sa ekstremnom tačnošću da bi se rizik od mutacija sveo na minimum. Prve informacije o regulaciji S faze su dobijene iz eksperimenata gde su dve ćelije fuzionisane u različitim fazama ciklusa (slika 3).

Slika 3 Prikaz eksperimenta o dokazivanju prisustva S-Cdk u ćelijama S-faze

• A - Kada se G1 ćelija spoji sa ćelijom koja je u S fazi, DNA replikacija se javlja u nukleusu G1 ćelije (najverovatnije izazvano prisustvom S-Cdk u ćeliji S faze).
• B - Fuzija G2 ćelije i ćelije u S fazi ne izaziva sintezu DNA u G2 nukleusu.
• C - Fuzija G1 i G2 ćelije ne izaziva nagli prelaz G1 ćelije u S fazu. To pokazuje da citoplazmatični faktori odgovorni za DNA replikaciju u S fazi, nestaju kada ćelija uđe u G2 fazu. U slučaju ove fuzije, G1 ćelija će ući u S fazu prateći signale iz svoje ćelije.

U ćelijama koje su u G1 fazi moguće je inicirati replikaciju DNA, dok u ćelijama koje su u G2 fazi nije moguće inicirati replikaciju DNA prisustvom aktivatora iz ćelije u S fazi. Očigledno, prolaz kroz mitozu je nepohodan da bi ćelija povratila sposobnost replikacije DNA.

Replikacija započinje u interakciji inicijatora i replikatora. Pod replikatorom podrazumevamo set sekvenci DNK koje su neophodne za inicijaciju replikacije i u okviru replikatora se nalazi i samo mesto početka replikacije. Vrlo važan momenat u replikaciji eukariota je činjenica da se svi replikoni ne “pale“ istovremeno. To je zapaženo odavno kod kvasca koji ima nekoliko stotina replikona, da postoje setovi replikona koji se sukcesivno uključuju, dakle replikacija ne započinje istovremeno na svim replikatorima.

Inicijator je protein ili kompleks proteina koji se vezuju za replikator, specificno prepoznaju određene nukleotidne sekvence i omogućavaju da replikacija započne. Kod eukariota je inicijator tzv. origin recognation complex, ORC. On se sastoji od 6 proteina, vezuje ATP, prepoznaje replikator i regrutuje druge regulatorne proteine za replikaciju.

Jedan od regulatornih proteina je Cdc6. Nivo ovog proteina je nizak tokom većine ćelijskog ciklusa. Njegova količina se povećava u ranoj G1 fazi. On se vezuje za ORC u ranoj G1 fazi i zajedno sa Mcm proteinima gradi proteinski prereplikativni kompleks, ili pre-RC. Prereplikativni kompleks se aktivira fosforilacijom proteina kompleksa ciklin zavisnom kinazom, S-Cdk (slika 4).

Slika 4 Stvaranje prereplikativnog kompleksa i inicijacija replikacije uz pomoć S-Cdk

S-Cdk su vrlo vazne za regulaciju inicijacije replikacije, tj. one određuju kada će neki replikator da bude aktivan, jer se aktivnost ovih kinaza u toku ćelijskog ciklusa menja. Ako dođe do aktivacije pre-RC ciklin zavisnim kinazama, onda će doći i do vezivanja DNK polimeraza. Početak S faze je početak replikacije. Najvažniji mehanizam regulacije replikacije je uz pomoc S-Cdk. Njihova aktivnost je u G1 fazi niska, i tada moze da dođe do formiranja prereplikativnog kompleksa, ali ne moze da dođe do njegove aktivacije. U S fazi aktivnost S-Cdk je visoka, i tada ne moze doci do formiranja novih prereplikativnih kompleksa (jer bi se i oni aktivirali i doslo bi do ponovnog zapocinjanja replikacije u jednoj istoj S fazi), ali dolazi do aktivacije postojećih (fosforilacijom). Znači od aktivnosti kinaza, koja je posebno regulisana, zavisi da li će replikacija početi, to je veoma složen proces (http://www.biolozi.net).

Kada je pre-RC komleks sastavljen u G1 fazi replikacija može početi. Aktivacija S-Cdk u kasnoj G1 fazi inicira replikaciju. Inicijacija replikacije takođe zahteva aktivnost druge protein kinaze , koja sarađuje sa S-Cdk i izaziva fosforilaciju ORC kompleksa.

S-Cdk ne inicira samo replikaciju, on i sprečava replikaciju na nekoliko načina. Prvo, omogućava disocijaciju Cdc6 od ORC nakon početka replikacije, rastavlja se pre-RC kompleks i tako se sprečava ponavljanje replikacije na istom mestu. Drugo, sprečava ponovno okupljanje Cdc6 i Mcm proteina na začetku replikacije. S-Cdk fosforiliše Cdc6 protein koji nije vezan za početak replikacije i na taj način Cdc6 degradira u proteozome. S-Cdk fosforiliše neke Mcm proteine, aktivira njihov izlazak iz jedra i omogućava da ovaj kompleks ne može da se vezuje za početak replikacije.

S-Cdk aktivnost ostaje na visokom nivou tokom G2 faze i na početku mitoze, sprečavajući replikaciju nakon završene S faze. M-Cdk takođe sprečava replikaciju tokom mitoze tako što fosforiliše Cdc6 i Mcm proteine.

Dakle, nekoliko Ciklin-Cdk kompleksa sarađuje i onemogućava rano stvaranje pre-RC kompleksa i sprečava replikaciju nakon S faze. Na kraju mitoze količina celokupne Cdk aktivnosti je svedena na nulu. Defosforilacijom Cdc6 i Mcm omogućava se stvaranje pre-RC kompleksa i ponovna replikacija tokom narednog ciklusa.

M-faza

Aktivacija M-faze – Ciklin Cdk kompleks (M-Cdk) kao okidač za ulazak u mitozu

U G2 fazi, ćelija ima udvostručenu DNA i priprema se za mitozu. Aktivacija M-Cdk počinje akumulacijom M-ciklina. U embrionalnim ćelijama sinteza M-ciklina je konstantna tokom ćelijskog ciklusa, a njegova količina se reguliše većom ili manjom degradacijom. Akumulacija M-ciklina je rezultat smanjene degradacije. U većini tipova ćelija sinteza M-ciklina se povećava tokom G2 i M faze, povećanom transkripcijom gena za M-ciklin. Što je ćelija bliža M fazi, koncentracija M–Cdk (kompleksa Cdk1 i M-ciklina) je veća. Aktivnost M-Cdk je potisnuta kada Wee1 kinaza fosforiliše dva specifična mesta (zbog jednostavnosti na slici je prikazano jedno mesto) na Cdk molekulu, koji se nalaze iznad aktivacijskog mesta (Slika 5).

Slika 5 Regulacija aktivnosti Cdk

Ključni događaj u aktivaciji M-Cdk je uklanjanje inhibitornih fosfata od strane fosfataze Cdc25, na kraju G2 faze (Slika 6) (Alena Buretić-Tomljanović, 2006).

Dve protein kinaze aktiviraju Cdc25, jedna poznata kao Polo kinaza, a druga je sama M-Cdk. M-Cdk takođe fosforiliše i inhibira Wee1 što obezbeđuje naglo povećanje aktivnosti M-Cdk.

Slika 6 Aktivacija M-Cdk

Sposobnost M-Cdk da aktivira sopstvenog aktivatora (Cdc25) i inhibira svog inhibitora (Wee1) pokazuje da je aktivacija M-Cdk pozitivna povratna sprega. Parcijalna aktivacija Cdc25, npr. pomoću Polo kinaze, dovodi do delimične aktivacije dela M-Cdk kompleksa, koji tada fosforiliše više Cdc25 i Wee1 molekula. Ovo dovodi do više M-Cdk defosforilizacije i aktivacije. Takav mehanizam brzo aktivira sve M-Cdk komplekse u ćeliji i omogućava nagli porast M-Cdk aktivnosti.

G2 kontrolna tačka - Nekompletna DNA replikacija blokira ulaz u mitozu

Ukoliko bi ćelija ušla u mitozu pre završene replikacije DNA, ćerke ćelije bi nakon deobe imale nepotpun set hromozoma. Ovo je izbegnuto u većini ćelija mehanizmom kontrolnih tačaka, koji omogućava da mitoza ne može početi sve dok se poslednji nukleotid ne iskopira. Senzorni mehanizmi, nepoznate molekularne prirode detektuju nerepliciranu DNA ili odgovarajuću nezavršenu replikacionu viljušku i šalju negativan signal sistemu za kontrolu ćelijskog ciklusa čime blokiraju aktivaciju M-Cdk enzima. Negativni signal kontrolne tačke aktivira protein kinazu koja inhibira Cdc25 protein fosfatazu (slike 5 i 6). Kao rezultat M-Cdk ostaje fosforilisana i neaktivna sve dok se ne završi replikacija DNA.

Da bi se pokazalo prisustvo kontrolne tačke, urađen je eksperiment (Slika 7). Ćelije sisara u kulturi su tretirane sa kofeinom, hidroksiureom i kofeinom i hidroksiureom zajedno. Hidroksiurea je hemijski inhibitor sinteze DNA, dok velike doze kofeina inhibiraju mehanizam kontolnih tačaka. Netretirane ćelije, postavljene kao kontrola, prolaze kroz ćelijski ciklus bez smetnji i rezultat je normalna mitoza. Ćelije tretirane kofeinom, takođe završavaju ćelijski ciklus uspešnom mitozom. Ćelije tretirane hemijskim ihnibitorima DNA sinteze kao sto su hidroksiurea ne vrše progres u mitozu, ćelijski ciklus zastaje u S fazi. DNA molekula je nereliplicirana, što aktivira mehanizam kontrolne tačke, koji zaustavlja ćelijski ciklus u S fazi i onemogućava ulazak u M fazu. Ukoliko je mehanizam kontrolnih tačaka neispravan, kao u ćelijama kvasca sa određenim mutacijama ili u ćelijama sisara koje su tretirane visokim dozama kofeina, ćelije ulaze u mitozu iako je DNA replikacija nezavršena, jer je kofein ihnibirao aktivnost kontrolne tačke, i to ze završava smrću ćerki ćelija.

Slika 7 Prikaz eksperimenta za dokazivanje prisustva kontrolne tačke

Autor teksta: Jelena Ačanski