Razlika između izmena na stranici „Metode analize hromozoma”
(→Tehnika traka visoke rezolucije) |
|||
| Red 7: | Red 7: | ||
Limfociti se gaje na podlozi koja sadrži materije za stimulaciju deoba [[T-limfociti|T-limfocita]], [[fitohemaglutinin]], na 37C, u sterilnim uslovima. Posle tri dana kulturi se dodaje [[citostatik]] [[kolhicin]] koji zaustavlja deobe u metafazi tako što spreči obrazovanje [[deobnogo vreteno|deobnog vretena]]. [[Metafaza]] je period deobe u kome se hromozomi najbolje vide jer su maksimalno kondezovani. Dodavanjem hipotoničnog rastvora, po zakonima osmoze voda ulazi u limfocite i dolazi do njihovog prskanja čime se hromozomi oslobode iz jedra, rasprše. Fiksiranjem, postavljanjem na predmetna stakla za mikroskop i bojenjem hromozomi postaju spremni za izučavanje. | Limfociti se gaje na podlozi koja sadrži materije za stimulaciju deoba [[T-limfociti|T-limfocita]], [[fitohemaglutinin]], na 37C, u sterilnim uslovima. Posle tri dana kulturi se dodaje [[citostatik]] [[kolhicin]] koji zaustavlja deobe u metafazi tako što spreči obrazovanje [[deobnogo vreteno|deobnog vretena]]. [[Metafaza]] je period deobe u kome se hromozomi najbolje vide jer su maksimalno kondezovani. Dodavanjem hipotoničnog rastvora, po zakonima osmoze voda ulazi u limfocite i dolazi do njihovog prskanja čime se hromozomi oslobode iz jedra, rasprše. Fiksiranjem, postavljanjem na predmetna stakla za mikroskop i bojenjem hromozomi postaju spremni za izučavanje. | ||
==Metode bojenja hromozoma== | ==Metode bojenja hromozoma== | ||
| − | Za identifikaciju pojedinačnih hromozoma koristi se nekoliko metoda bojenja, tehnika traka: | + | Za identifikaciju pojedinačnih hromozoma koristi se nekoliko metoda bojenja, tehnika traka otkrivena 1971, godine: |
* '''tehnika G traka''', koristi se najčešće; hromozomi se boje Gimza (Giemsa) bojom koja se vezuje za DNK pri čemu se dobija karakterističan raspored svetlih i tamnih traka; | * '''tehnika G traka''', koristi se najčešće; hromozomi se boje Gimza (Giemsa) bojom koja se vezuje za DNK pri čemu se dobija karakterističan raspored svetlih i tamnih traka; | ||
*'''tehnika Q traka''', koristi se boja quinacrine i dobija se sličan raspored traka samo što se hromozomi moraju da posmatraju ultravioletnim fluorescentnim milroskopom; | *'''tehnika Q traka''', koristi se boja quinacrine i dobija se sličan raspored traka samo što se hromozomi moraju da posmatraju ultravioletnim fluorescentnim milroskopom; | ||
*'''tehnika R traka''' daje na hromozomima trake koje su suprotne (R kao ''reverse'') od onih koje daje tehnika G traka; upotrebljava se ispitivanje [[heterohromatin]]a i [[telomera]]; | *'''tehnika R traka''' daje na hromozomima trake koje su suprotne (R kao ''reverse'') od onih koje daje tehnika G traka; upotrebljava se ispitivanje [[heterohromatin]]a i [[telomera]]; | ||
*'''tehnika C traka''', kojom se posle tretiranja kiselinom i bazom i bojenja Gimzom, pojedini regioni hromozoma, kao što je centromera i drugi heterohromatinski regioni (C kao ''centromerni heterohromatin'') vide kao tamno obojeni; | *'''tehnika C traka''', kojom se posle tretiranja kiselinom i bazom i bojenja Gimzom, pojedini regioni hromozoma, kao što je centromera i drugi heterohromatinski regioni (C kao ''centromerni heterohromatin'') vide kao tamno obojeni; | ||
| − | ==Tehnika traka visoke rezolucije== | + | ===Tehnika traka visoke rezolucije=== |
Ova tehnika je je zahtevnija i njome se dobija detaljniji raspored traka na hromozomima. Ako se analiza hromozoma radi tehnikom G traka, onda se dobija 400-500 traka po jednoj haploidnoj garnituri hromozoma čoveka pri čemu svaka traka sadrži oko 6000 - 8000 kilobaza iz [[DNK]]. Tehnikom traka visoke rezolucije radi se na hromozomima koji su zaustavljeni u profazi ili prometafazi. Tada hromozomi nisu potpuno kondenzovani pa su osetljiviji čime je omogućeno dobijanje detaljnijeg broja, čak 800 traka po haploidnoj broju hromozoma. | Ova tehnika je je zahtevnija i njome se dobija detaljniji raspored traka na hromozomima. Ako se analiza hromozoma radi tehnikom G traka, onda se dobija 400-500 traka po jednoj haploidnoj garnituri hromozoma čoveka pri čemu svaka traka sadrži oko 6000 - 8000 kilobaza iz [[DNK]]. Tehnikom traka visoke rezolucije radi se na hromozomima koji su zaustavljeni u profazi ili prometafazi. Tada hromozomi nisu potpuno kondenzovani pa su osetljiviji čime je omogućeno dobijanje detaljnijeg broja, čak 800 traka po haploidnoj broju hromozoma. | ||
==Analiza kariotipa== | ==Analiza kariotipa== | ||
| + | Prvo se određuje broj hromozoma na osnovu njihovog brojanja u najčešće 10 - 15 ćelija. Nekada se broji i u većem broju kao npr. u slučaju [[mozaicizam|mozaicizma]] što se broje hromozomi u više od 30 ćelija. Prebrojani hromozomi se zatim analiziraju prema rasporedu traka koji je specifičan za svaki pojedinačni hromozom. To se radi ili pod mikroskopom ili, češće, izučavanjem fotografija raspršenih hromozoma u metafazi. | ||
Izmena na datum 4. novembar 2009. u 21:11
Metode analize hromozoma koriste se u citogenetskim laboratorijama za analizu broja, veličine i oblika hromozoma. Tijo i Levan su 1956. metodama, koje se i danas, uz određene promene, koriste odredili tačan broj hromozoma u kariotipu čoveka. Do njihovog otkrića vladalo je mišljenje da se u telesnim ćelijama čoveka nalazi 48 hromozoma. Zahvaljujući ispitivanjima i određenim metodama Tijo i Levan su došli do zaključka da somatska ćelija čoveka ima 46 hromozoma.
Sadržaj
Priprema hromozoma
Svaka živa ćelija koja ima sposobnost da se deli i sadrži jedro, može se koristiti za proučavanje hromozoma. Najčešće se u te svrhe koriste limfociti periferne krvi, a sa istom uspešnošću moguće je upotrebiti i ćelije kože, kičmene moždine, horionskih resica, iz amnionske tečnosti i dr.
Limfociti se gaje na podlozi koja sadrži materije za stimulaciju deoba T-limfocita, fitohemaglutinin, na 37C, u sterilnim uslovima. Posle tri dana kulturi se dodaje citostatik kolhicin koji zaustavlja deobe u metafazi tako što spreči obrazovanje deobnog vretena. Metafaza je period deobe u kome se hromozomi najbolje vide jer su maksimalno kondezovani. Dodavanjem hipotoničnog rastvora, po zakonima osmoze voda ulazi u limfocite i dolazi do njihovog prskanja čime se hromozomi oslobode iz jedra, rasprše. Fiksiranjem, postavljanjem na predmetna stakla za mikroskop i bojenjem hromozomi postaju spremni za izučavanje.
Metode bojenja hromozoma
Za identifikaciju pojedinačnih hromozoma koristi se nekoliko metoda bojenja, tehnika traka otkrivena 1971, godine:
- tehnika G traka, koristi se najčešće; hromozomi se boje Gimza (Giemsa) bojom koja se vezuje za DNK pri čemu se dobija karakterističan raspored svetlih i tamnih traka;
- tehnika Q traka, koristi se boja quinacrine i dobija se sličan raspored traka samo što se hromozomi moraju da posmatraju ultravioletnim fluorescentnim milroskopom;
- tehnika R traka daje na hromozomima trake koje su suprotne (R kao reverse) od onih koje daje tehnika G traka; upotrebljava se ispitivanje heterohromatina i telomera;
- tehnika C traka, kojom se posle tretiranja kiselinom i bazom i bojenja Gimzom, pojedini regioni hromozoma, kao što je centromera i drugi heterohromatinski regioni (C kao centromerni heterohromatin) vide kao tamno obojeni;
Tehnika traka visoke rezolucije
Ova tehnika je je zahtevnija i njome se dobija detaljniji raspored traka na hromozomima. Ako se analiza hromozoma radi tehnikom G traka, onda se dobija 400-500 traka po jednoj haploidnoj garnituri hromozoma čoveka pri čemu svaka traka sadrži oko 6000 - 8000 kilobaza iz DNK. Tehnikom traka visoke rezolucije radi se na hromozomima koji su zaustavljeni u profazi ili prometafazi. Tada hromozomi nisu potpuno kondenzovani pa su osetljiviji čime je omogućeno dobijanje detaljnijeg broja, čak 800 traka po haploidnoj broju hromozoma.
Analiza kariotipa
Prvo se određuje broj hromozoma na osnovu njihovog brojanja u najčešće 10 - 15 ćelija. Nekada se broji i u većem broju kao npr. u slučaju mozaicizma što se broje hromozomi u više od 30 ćelija. Prebrojani hromozomi se zatim analiziraju prema rasporedu traka koji je specifičan za svaki pojedinačni hromozom. To se radi ili pod mikroskopom ili, češće, izučavanjem fotografija raspršenih hromozoma u metafazi.
