Metode analize hromozoma

Metode analize hromozoma koriste se u citogenetskim laboratorijama za analizu broja, veličine i oblika hromozoma. Tijo i Levan su 1956. metodama, koje se i danas, uz određene promene, koriste odredili tačan broj hromozoma u kariotipu čoveka. Do njihovog otkrića vladalo je mišljenje da se u telesnim ćelijama čoveka nalazi 48 hromozoma. Zahvaljujući ispitivanjima i određenim metodama Tijo i Levan su došli do zaključka da somatska ćelija čoveka ima 46 hromozoma.

Priprema hromozoma

G trake

Q trake

Svaka živa ćelija koja ima sposobnost da se deli i sadrži jedro, može se koristiti za proučavanje hromozoma. Najčešće se u te svrhe koriste limfociti periferne krvi, a sa istom uspešnošću moguće je upotrebiti i ćelije kože, kičmene moždine, horionskih resica, iz amnionske tečnosti i dr.

Limfociti se gaje na podlozi koja sadrži materije za stimulaciju deoba T-limfocita, fitohemaglutinin, na 37C, u sterilnim uslovima. Posle tri dana kulturi se dodaje citostatik kolhicin koji zaustavlja deobe u metafazi tako što spreči obrazovanje deobnog vretena. Metafaza je period deobe u kome se hromozomi najbolje vide jer su maksimalno kondezovani. Dodavanjem hipotoničnog rastvora, po zakonima osmoze voda ulazi u limfocite i dolazi do njihovog prskanja čime se hromozomi oslobode iz jedra, rasprše. Fiksiranjem, postavljanjem na predmetna stakla za mikroskop i bojenjem hromozomi postaju spremni za izučavanje.

Metode bojenja hromozoma

Za identifikaciju pojedinačnih hromozoma koristi se nekoliko metoda bojenja, tehnika traka otkrivena 1971, godine:

• tehnika G traka, koristi se najčešće; hromozomi se boje Gimza (Giemsa) bojom koja se vezuje za DNK pri čemu se dobija karakterističan raspored svetlih i tamnih traka;
• tehnika Q traka, koristi se boja quinacrine i dobija se sličan raspored traka samo što se hromozomi moraju da posmatraju ultravioletnim fluorescentnim milroskopom;
• tehnika R traka daje na hromozomima trake koje su suprotne (R kao reverse) od onih koje daje tehnika G traka; upotrebljava se ispitivanje heterohromatina i telomera;
• tehnika C traka, kojom se posle tretiranja kiselinom i bazom i bojenja Gimzom, pojedini regioni hromozoma, kao što je centromera i drugi heterohromatinski regioni (C kao centromerni heterohromatin) vide kao tamno obojeni;

Tehnika traka visoke rezolucije

Ova tehnika je je zahtevnija i njome se dobija detaljniji raspored traka na hromozomima. Ako se analiza hromozoma radi tehnikom G traka, onda se dobija 400-500 traka po jednoj haploidnoj garnituri hromozoma čoveka pri čemu svaka traka sadrži oko 6000 - 8000 kilobaza iz DNK. Tehnikom traka visoke rezolucije radi se na hromozomima koji su zaustavljeni u profazi ili prometafazi. Tada hromozomi nisu potpuno kondenzovani pa su osetljiviji čime je omogućeno dobijanje detaljnijeg broja, čak 800 traka po haploidnoj broju hromozoma.

Analiza kariotipa

Prvo se određuje broj hromozoma na osnovu njihovog brojanja u najčešće 10 - 15 ćelija. Nekada se broji i u većem broju kao npr. u slučaju mozaicizma što se broje hromozomi u više od 30 ćelija. Prebrojani hromozomi se zatim analiziraju prema rasporedu traka koji je specifičan za svaki pojedinačni hromozom. To se radi ili pod mikroskopom ili, češće, izučavanjem fotografija raspršenih hromozoma u metafazi.

Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)

Ova metoda se koristi u kliničkoj dijagnostici. Zasniva na sposobnosti jednolančane DNK da hibridizuje. Postoje utvrđeni jednolančani delovi DNK koji predstavljaju tzv. probe obeležene fluorohromom tako da se mogu videti pod fluorescentnim mikroskopom. Uzorak DNK uzet od pacijenta hibridizuje sa probom, a zatim se region u kome je izvršena hibridizacija posmatra fluorescentnim mikroskopom.

Tipovi FISH proba

M-FISH metoda

Postoji veliki broj različitih tipova FISH proba koje su danas u upotrebi:

• centromerne probe se sastoje od sekvenci DNK koje se ponavljaju u predelu centromere određenih hromozoma i mogu se koristiti kod ćelija koje se ne dele (pr. ćelije horionskih resica za prenatalnu dijagnostiku trizomije hromozoma);
• probe za jedinstvene sekvence hromozoma specifične su za određeno mesto gena na hromozomu (genski lokus)
• telomerne probe urađene su za svih 24 hromozoma kod čoveka: 22 autozoma kao i X i Y hromozome; pomoću njih se mogu utvrditi delecije i translokacije u subtelomernim regionima koje dovode do pojave neobjašnjivih mentalnih poremećaja kod dece;
• probe za bojenje celih hromozoma se koriste kao smeša proba dobijenih iz različitih delova hromozoma koje, kada se koriste zajedno, daju sliku celog hromozoma;
• multipli FISH (M-FISH) je smeša obojenih proba za sve hromozome čoveka čijom primenom se dobija višebojni kariotip čoveka u kome svaki par hromozoma može biti određen na osnovu za njega karakteristične boje i izučavan pomoću kompjuterskog programa koji analizira sliku

Literatura

• Dumanović, J, marinković, D, Denić, M: Genetički rečnik, Beograd, 1985.
• Emery, A, H (2009): Osnovi medicinske genetike, Datastatus, Beograd
• Kosanović, M, Diklić, V: Odabrana poglavlja iz humane genetike, Beograd, 1986.
• Lazarević, M: Ogledi iz medicinske genetike, beograd, 1986.
• Marinković, D, Tucić, N, Kekić, V: Genetika, Naučna knjiga, Beograd
• Matić, Gordana: Osnovi molekularne biologije, Zavet, Beograd, 1997.
• Prentis S: Biotehnologija, Školska knjiga, Zagreb, 1991.
• Ridli, M: Genom - autobiografija vrste u 23 poglavlja, Plato, Beograd, 2001.
• Tatić, S, Kostić, G, Tatić, B: Humani genom, ZUNS, Beograd, 2002.
• Tucić, N, Matić, Gordana: O genima i ljudima, Centar za primenjenu psihologiju, Beograd, 2002.
• Švob, T. i sradnici: Osnovi opće i humane genetike, Školska knjiga, Zagreb, 1990.