Metode analize hromozoma
Metode analize hromozoma koriste se u citogenetskim laboratorijama za analizu broja, veličine i oblika hromozoma. Tijo i Levan su 1956. metodama, koje se i danas, uz određene promene, koriste odredili tačan broj hromozoma u kariotipu čoveka. Do njihovog otkrića vladalo je mišljenje da se u telesnim ćelijama čoveka nalazi 48 hromozoma. Zahvaljujući ispitivanjima i određenim metodama Tijo i Levan su došli do zaključka da somatska ćelija čoveka ima 46 hromozoma.
Priprema hromozoma
Svaka živa ćelija koja ima sposobnost da se deli i sadrži jedro, može se koristiti za proučavanje hromozoma. Najčešće se u te svrhe koriste limfociti periferne krvi, a sa istom uspešnošću moguće je upotrebiti i ćelije kože, kičmene moždine, horionskih resica, iz amnionske tečnosti i dr.
Limfociti se gaje na podlozi koja sadrži materije za stimulaciju deoba T-limfocita, fitohemaglutinin, na 37C, u sterilnim uslovima. Posle tri dana kulturi se dodaje citostatik kolhicin koji zaustavlja deobe u metafazi tako što spreči obrazovanje deobnog vretena. Metafaza je period deobe u kome se hromozomi najbolje vide jer su maksimalno kondezovani. Dodavanjem hipotoničnog rastvora, po zakonima osmoze voda ulazi u limfocite i dolazi do njihovog prskanja čime se hromozomi oslobode iz jedra, rasprše. Fiksiranjem, postavljanjem na predmetna stakla za mikroskop i bojenjem hromozomi postaju spremni za izučavanje.
Metode bojenja hromozoma
Za identifikaciju pojedinačnih hromozoma koristi se nekoliko metoda bojenja, tehnika traka:
- tehnika G traka, koristi se najčešće; hromozomi se boje Gimza (Giemsa) bojom koja se vezuje za DNK pri čemu se dobija karakterističan raspored svetlih i tamnih traka;
- tehnika Q traka, koristi se boja quinacrine i dobija se sličan raspored traka samo što se hromozomi moraju da posmatraju ultravioletnim fluorescentnim milroskopom;
- tehnika R traka daje na hromozomima trake koje su suprotne (R kao reverse) od onih koje daje tehnika G traka; upotrebljava se ispitivanje heterohromatina i telomera;
- tehnika C traka, kojom se posle tretiranja kiselinom i bazom i bojenja Gimzom, pojedini regioni hromozoma, kao što je centromera i drugi heterohromatinski regioni (C kao centromerni heterohromatin) vide kao tamno obojeni;
Tehnika traka visoke rezolucije
Ova tehnika je je zahtevnija i njome se dobija detaljniji raspored traka na hromozomima. Ako se analiza hromozoma radi tehnikom G traka, onda se dobija 400-500 traka po jednoj haploidnoj garnituri hromozoma čoveka pri čemu svaka traka sadrži oko 6000 - 8000 kilobaza iz DNK. Tehnikom traka visoke rezolucije radi se na hromozomima koji su zaustavljeni u profazi ili prometafazi. Tada hromozomi nisu potpuno kondenzovani pa su osetljiviji čime je omogućeno dobijanje čak 800 traka po haploidnoj broju hromozoma.