Nitroglicerinom indukovana oksidaciona oštecenja eritrocita pacova

Seminarski rad 

UVOD

Izgled eritrocita - poprecni presek

Prikaz hem grupe

Struktura hemoglobina

Eritrociti (Red Blood Cells-RBCs)

Krvne celije vode poreklo od pluripotentnih hematopoeznih matičnih celija koje se dele čitavog života. Neke bivaju identične izvornim ćelijama i ostaju u koštanoj srži, da bi se održala zaliha tih celija, ali se većina diferencira. Rani potomci se nazivaju opredeljene maticne celije koje proizvode kolonije odovarajucih tipova krvnih celija. One koje proizvode eritrocite su CFU-E (colony-formig unit-erytrocyte). Od CFU-E nastaje proeritroblast koji daje bazofilne eritrocite sa veoma malo hemoglobina-Hb. U sledecim generacijama celije se napune Hb do koncentracije približno 34%; jedro se kondenzuje do male zapremine i njegov krajnji ostatak se izbaci iz ćelije, endoplazmatski retikulum se degradira i celija se u ovom stadijumu zove retikulocit. On sadrži malo bazofilne materije koju cine Goldžijev kompleks, mitohondrije. Ostatak bazofilne materije išcezne za dan-dva i tada nastaje eritrocit [1].

Normalni eritrociti su oblika bikonkavnog diska, dijametra 7,8 μm, na širem kraju 2,5 μm, a u sredini 1 μm . Dijametar kapilara u kapilarnoj mreži je približan velicini eritrocita i iznosi 8 μm, što je važno za lakši prolazak gasova; ugljendioksida (CO2) i kiseonika (O2) iz eritrocita u spoljašnju sredinu i obrnuto. Glavna uloga RBCs je transport kiseonika vezanog za Hb do tkiva svih organa. Hb je hromoproteid, sacinjen od prosteticne grupe –hema (Slika 2) i belancevinaste komponente. Hem cini protoporfirin i gvožðe Fe2+. Kada se hem veže za globin (koga cine 2á i 2ß lanca) nastaje Hb. Kako svaki lanac Hb sadži po jedan hem, svaki hem reverzibilno vezuje po jedan molekul O2, Hb ukupno veže 4 molekula O2. Eritrociti imaju sposobnost da koncentrišu Hb u svojoj celijskoj tecnosti do 34 g/dl celija [1].

Eritrociti se proizvode u koštanoj srži, ilijacnim kostima, sternumu, rebrima i kicmenim pršljenovima i životni vek im je u krvi 120 dana. Osim uloge u transportu O2, RBC su dobar acido-bazni pufer. Sadrže veliku količinu karboanhidraze, koja katalizuje reakciju izmeðu CO2 i H2O tako da povecava brzinu ove reverzibilne reakcije i do nekoliko hiljada puta. Brzina ove reakcije omogucava da u krvi voda reaguje sa velikom kolicinom CO2 tako da se on transportuje od tkiva od pluca u obliku bikarbonatnih jona (HCO3-) [1].

Eritropoetin je glikoprotein, hormon koji stimuliše produkciju RBCs, vecinom se stvara u bubrezima, a manji deo u jetri. Bez eritropoetina hipoksija ima mali ili nema nikakav uticaj na produkciju eritrocita. Kada je eritropoetinski sistem funkcionalan hipoksija izaziva znatan porast produkcije eritropoetina, a on pojacava produkciju eritrocita sve dok se hipoksija ne ukloni [1]. Citoplazma RBCs sadrži enzime sposobne da metabolišu glukozu i sintetišu malu kolicinu ATP-a i posebno, NADPH i NADH. Oni imaju uloge u održavanju savitljivosti celijske membrane, održavanju transporta jona kroz membranu, održavanju gvožða u fero Fe2+, a ne feri obliku Fe3+ kao što je u methemoglobinu (metHb) koji ne prenosi O2 i u sprecavanju oksidacije proteina u RBCs. Raspadanje RBCs je u slezini gde su prostori izmeðu strukturnih trabekula crvene pulpe široki samo 3 μm. Kada membrana RBCs postane fragilna ona prska i iz njih se oslobaða Hb, koga odmah fagocitiraju makrofagi u mnogim oblastima organizma, ali narocito Kupferove (Kuffer) ćelije u jetri, slezini i koštanoj srži. Osloboðeno gvožðe se transportuje u sastavu transferina u koštanu srž gde se koristi za produkciju novih RBCs, ili u jetru i druga tkiva radi skladištenja u obliku feritina. Porfirinski deo Hb se u nekoliko stadijuma pretvara u makrofagima u žucni pigment bilirubin, koji se oslobaða u krv, a zatim ga jetra izlucuje u žuc [1].

Oksidacioni stres

Molekulski kiseonik se u celijama aerobnih organizama redukuje do vode. Ovaj proces se odvija na unutrašnjoj strani membrane mitohondrija uz kataliticku ulogu kompleksa citohrom oksidaza. Svaki molekul kiseonika veže 4 elektrona. Pri redukciji molekularnog kiseonika manjim brojem elektrona, u îkî 2% slucajeva nastaju delimicno redukovani meðuproizvodi, nazvani reaktivne vrste kiseonika. To su molekuli, joni ili atomi koji imaju jedan ili više nesparenih elektrona u svojoj strukturi [2].

Reaktivne vrste kiseonika obuhvataju pored slobodnih radikala kiseonika (superoksidanjon radikal, hidroksil radikal, peroksil, hidroperoksil radikale) i reaktivne vrste kiseonika koji nisu radikali (vodonik peroksid, hipohlorna kiselina, ozon, singlet kiseonik).

Oštećenja ćelije

Reaktivne vrste mogu da izazovu mnoga oštecenja, npr. oštecenja DNK, destrukije nukleotidnih koenzima, poremecaja SH-zavisnih enzima, kovalentnog vezivanja molekula, što dovodi do fragmentacije i proteolize, kao i do oštecenja celijske membrane. Pored reaktivnih vrsta kiseonika u organizmu se javljaju reaktivne vrste ugljenika, sumpora i azota (i to od radikala: azot oksid (NO.), azot dioksid (NO2 .), a od neradikala: azotasta kiselina (HNO2), azot trioksid (N2O3), azot tetraoksid (N2O4), nitronijum (NO2 +) (nitril) jon, peroksinitrit (ONOO -)) [4].

Sistem zaštite od oksidacionih oštecenja

Sistem zaštite od oksidacionih oštecenja obuhvata primarnu (enzimske i neenzimske komponente) i sekundarnu antioksidacionu zaštitu (protein specificne oksidoreduktaze, ATP, i Ca2+-nezavisne proteaze) [3]. U enzimske komponente se ubrajaju enzimi: superoksiddismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation-peroksidaza (GSH-Px), glutation-S-transferaza (GST) è glutation-reduktaza (GR). Neenzimske komponente cine supstance rastvorljive u mastima (vitamin E, vitamin A, bilirubin,), supstance rastvorljive u vodi (vitamin C, glutation (GSH), mokracna kiselina, cistein, albumin, glukoza, flavonoidi itd.) [3]. U organizmu mogu da nastanu i organski radikali, u interakcijama ROS sa biološkim makromolekulima. Najbolje opisan mehanizam je proces lipidne peroksidacije, koja može da dovede do degradacije lipidnih membrana, interakcije degradacionih produkata sa razlicitim ciljevima u celiji i izvan nje, produkciju novih ROS u toku lancane reakcije [3].

Azot monoksid (NO)

Azot monoksid (NO) je gas bez boje, ukusa i mirisa, nezapaljiv, toksican pri visokim koncentracijama, nestabilan i sa kiseonikom gradi toksican NO2. Normalno se stvara u endotelnim celijama, u neutrofilima i makrofagima, u epitelnim celijama gornjih disajnih puteva i u bilo kom drugom tkivu podvrgnutom ishemiji i inflamaciji. NO se inaktiviše vezivanjem za Hb za manje od jedne sekunde ili za nekoliko sekundi pri cemu se stvara metHb [5]. Azot oksid sintaza (NOS) je enzim koji biokatalizuje produkciju NO u živim sistemima [6]. NO je prvo identifikovan kao endotelijalni faktor koji dovodi do relaksacije krvnih sudova.

Podela izoformi NOS

Intenzivna izucavanja aktiviranih makrofaga, neurona i endotelijalnih celija su dovela do detekcije NOS. Danas je usvojena podela izoformi NOS na:

• NOS tipa É cija aktivnost zavisi od nivoa Ca2+ i koja je prvi put otkrivena u

neuronima;

• NOS tipa ÉÉ cija aktivnost ne zavisi od koncentracije Ca2+;
• NOS tipa ÉÉÉ cija aktivnost zavisi od nivoa Ca2+ i koja je prvi put otkrivena u

endotelijalnim celijama [6]; Neuralna i endotelna NOS su konstitutivni tip, a NOS II je indukovani tip. Sva tri tipa imaju bidomensku strukturu – N-terminalni oksigenazni domen koji sadrži vezivna mesta za hem, tetrahidrobioprotein (BH4) i L-arginin. Na C-terminalnom reduktaznom domenu nalaze se vezivna mesta za FAD, FMN i NADPH [6].

Dokazano je da ljudske RBCs imaju aktivnu endotelijalnu NOS (eNOS), koja je lokalizovana u plazmamembrani i citoplazmi RBCs. Ova eNOS je regulisana svojim supstratima L-argininom, kalcijumom, i fosforilacijom preko PI3 kinaze [7]. NO se sintetiše iz L-arginina, preko intermedijera do L-citrulina uz ucešce pet elektrona, pet kofaktora, odnosno prosteticnih grupa, i tri kosupstrata (arginin, molekulski koseonik i NADPH). Guanidino grupa iz arginina je donor azotovog atoma u NO, atom kiseonika potice iz O2, a elektroni poticu iz NADPH. Na C-terminalnom domenu je vezivno mesto za NADPH, gde se redukuje FAD koji je u neposrednoj blizini, koji potom redukuje FMN. U prisustvu NADPH, a u odsustvu arginina NOS se ponaša kao donor elektrona i redukuje tetrazonijum soli, a kad je prisutan kiseonik on njega prevodi u superoksid anjon radikal (O2--). BH4 ucestvuje u konverziji arginina na citrulin [6]. Kalmodulin vezujuce mesto je lokalizovano izmeðu oksigenaznog i reduktaznog domena, vezivanje kalmodulina dovodi do prostorne promene u molekulu, dovodeci ova dva kraja u neposrednu blizinu i time omogucavajuci da se transfer elektrona sa NADPH na hem obavi pravilno [6].

Pri normalnim mirujucim uslovima koncentracije jona Ca2+, oba tipa NOS I i NOS III, su neaktivni, ali ako dođe do porasta koncentracije, to povecava vezivanje kalmodulina za NOS dovodeci do aktivacije enzima. U neuronima, tokom prostiranja akcionog potencijala doci ce do promene koncentracije Ca2+, što ce voditi do povecanja sinteze NO. Na taj nacin, sve dok traje ovakva promena u celiji, NO ostvaruje svoju ulogu neurotransmitera. Stres ili vezivanje receptora za endotelijalne celije takoðe vodi povecanju intracelularne koncentracije kalcijuma, što dovodi do produkcije NO i vazodilatacije krvnih sudova. Ukoliko bi došlo do povecanja sinteze NO i potrošnje arginina iz njegovog pula, potencijalni oksidacioni stres koji bi nastao usled produkcije O2--, sprecen je pojacanim prevoðenjem L-citrulina u arginin u ciklusu uree. NO je i sam inhibitor azot oksid sintaza [6].

• nastavak teksta Eritrociti i azot monoksid

Autor teksta: Jasmina Milovanović, dipl. biolog

Literatura

• [1] GYTON AC, HALL J: Medicinska fiziologija, deveto izdanje 413-419, 1999.
• [2] HALLIWELL B: Lipid peroxidation, antioxidants and cardiovascular disease: How should we move forward. Cardiovas. Res. 47: 410-418, 2000.
• [3] ŽIKIC RV, ŠTAJN AŠ, SAICIC ZS, SPASIC MB, MILOVANOVIC SR: Toksikološki znacaj zaštite od oksidacionih oštecenja. Monografija 1-150, 2000.
• [4] HALLIWELL B, GUTTERIDGE JM: Cross CE. Free radicals, antioxidants, and human disease: where are we now? J Lab Clin Med. 119:598–620, 1992.
• [5] MARKOVIC NA: Lecenje ADRS-a azot monoksidom, VMA Beograd Pdf.
• [6] DAVID RJ, BLAGOJEVIC D, SPASIC, B.M: Molekularna fiziologija 32-39, 2006.
• [7] KLEINBORGARD P, SCHULZ R, RASSAF T, THOMAS T, DEJAM A, JAX T, et al.: Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood 107 (7): 2943-2951, 2006.
• [8] COKIC VP, SCHECHTER AN: Effects of nitric oxide on red blood cell development and phenotype. Curr Top Dev Biol. 82: 169-215, 2008.
• [9] HAN TH, LIAO JC: Erythrocyte nitric oxide transport reduced by a submembrane cytoskeletal barrier. Biochim Biophys Acta 1723:135–142, 2005.
• [10] HUANG TK., HUANG Z AND KIM-SHAPIRO BD: Nitric Oxide Red Blood Cell Membrane Permeability at high and low Oxygen Tension. Nitric okside. 16(2): 209-216, 2007.
• [11] HUANG TK, HAN TH, HYDUKE DR, VAUGHN MW, HERLE HV, HEIN, TW: Modulation of nitric oxide bioavailability by erythrocytes. Proc Natl Acad Sci USA 98: 11771-11776, 2007.
• [12] PAWLOSKI JR, HESS DT, STAMLER JS,: Export by red blood cells of nitric oxide bioactivity. Nature 409(6820): 577-8, 2001.
• [13] GRUBINA R, HUANG Z, SHIVA S, JOSHI MS, AZAROV I, BASU S: Concerted Nitric Oxide Formation and Release from the Simultaneous Reactions of Nitrite with Deoxy- and Oxyhemoglobin J. Biol. Chem. 282(17): 12916-12927, 2007.
• [14] SIBMO N, PIKNOVA B, RIZZATTI F, SCHECHTER AN: Oxidation of iron-nitrosylhemoglobin by dehydroascorbic acid releases nitric oxide to form nitrite in human erythrocytes. Biochemistry. 47(9): 2989-96, 2008.
• [15] LUCHSINGER BP, RICH EN, GOW AJ, WILLIAMS EM, STAMLER JS: Routes to S-nitrosohemoglobin formation with heme redox and preferential reactivity in the â subunits. Proc Natl Acad Sci USA 100: 461-466, 2003.
• [16] LATERREUR J: Hemoglobin S-nitrosation on oxygenation of nitrite/deoxyhemoglobin incubations is attenuated by methemoglobin. J Inorg Biochem. 101(11-12):1827-35, 2007.
• [17] MALETIC SD: Efekti nitro preparata na oksidaciono-antrioksidacioni metabolizam crvenih krvnih celija pacova. Doktorska disertacija, 2004.
• [18] WINK DA, KATRINA M MIRANDA AND ESPEY M G: Cytotoxicity Related to Oxidative and Nitrosative Stress by Nitric Oxide. Symposia. Radiation Biology Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD, 20892
• [19] WIMALAWANSA SJ: Nitric oxide: new evidence for novel therapeutic indications. Expert Opin Pharmacother. 9 (11): 1935-54, 2008.
• [20] RUBBO H, RADI R, TRUJILLO M, TELLERI R, KALYANARAMAN B, BARNES S: Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation. Formation of novel nitrogen-containing oxidized lipid derivatives. J Biol Chem 269: 26066-26075, 1994.
• [21] BRZESZCZYNSKA J, GWOZDZINSKI K: Nitric oxide induced oxidative changes in erythrocyte membrane components.Cell Biol Int. 32(1): 114-20, 2008.
• [22] NICOLAY JP, LIEBIG G, NIEMOELLER OM, KOKA S, GHASHGHAEINIA M, WIEDER T, HAENDELER J, BUSSE R, LANG F: Inhibition of suicidal erythrocyte death by nitric oxide. Pflugers Arch. 456(2): 293-305, 2008.
• [23] Podaci su preuzeti iz Wikipedije.Wikipedia®
• [24] MC GUIRE JJ, ANDERSON DJ, MCDONALD BJ, NARAYANASAMI R, BENNETT BM: Inhibition of NADPH-cytochrome P450 reductase and glyceryl trinitrate biotransformation by diphenyleneiodonium sulfate. Biochem Pharmacol 56: 881-893, 1996.
• [25] CHEN Z, ZHANG J, STAMLER JS: Identification of the enzymatic mechanism of nitroglycerin bioactivation. Proc Natl Acad Sci USA 99: 8306-8311, 2002.
• [26] HARRISON DG, KURZ S, TARPEY M, FREEMAN B, MÜNZEL TH: Increased vascular superoxide production: a novel mechanism underlying nitrate tolerance. In: Münzel Th, Harrison DG, Just H, eds. Nitrates in Cardiovascular Disease. Basic Mechanisms of Action, Tolerance Phenomena, Clinical Applications. Verlag, Broken: Medizin & Wissenschaft. 53-56, 1996.
• [27] DAIBER A, WENZEL P, OELZE M, MÜNZEL T: New insights into bioactivation of organic nitrates, nitrate tolerance and cross-tolerance. Clin Res Cardiol. 97(1): 12-20, 2008.
• [28] MUNZEL T, SAYEGH H, FREEMAN BA, TARPEY MM, HARRISON DG: Evidence for enhanced vascular superoxide anion production in nitrate tolerance. A novel mechanism underlying tolerance and cross-tolerance. J Clin Invest 95 187–194, 1995.
• [29] WINK DA, MITCHELL JB: Chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radic Biol Med: 25: 434-456, 1998.
• [30] DI FABIO J, JI Y, VASILIOU V, THATCHER G R, BRNNETT B: Role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase in nitrate tolerance. Mol Pharmacol 64:1109-1116, 2003.
• [31] ROMERO N, RADI R, LINARES E, AUGUSTO O, DETWEILER CD, MASON RP,DENICOLAS A: Reaction of human hemoglobin with peroxynitrite. Isomerization to nitrate and secondary formation of protein radicals. J Biol Chem 278: 44049-44057, 2003.
• [32] ARESE P, DE FLORA A: Pathophysiology of hemolysis in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Semin Hematol 27: 1-40, 1990.
• [33] MALETIC SD, DRAGICEVIC-ÐOKOVIC LJM, ŽIKIC RV, ŠTAJN AŠ, MILENKOVIC P,KOSTIC MM: Effects of nitric oxide donors on energy metabolism of rat erythrocytes. J Environ Pathol Toxicol Oncol 19: 383-390, 2000.
• [34] BROWN KE, KNUDSEN CA: Oxidized heme proteins in an animal model of hemochromatosis. Free Radic Biol Med: 24: 239-244, 1998.
• [35] KOZLOV VA, DIETRICH B, NOHL H: Various intracellular compartments cooperate in the release of nitric oxide from glycerol trinitrate in liver. British Journal of Pharmacology 139: 989–997,2003.
• [36] MARKOVIC SD, OGNJANOVIC BI, STAJN AS, ZIKIC RV, SAICIC ZS, RADOJICIC RM, SPASIC MB: The effects of nitroglycerine on the redox status of rat erythrocytes and reticulocytes. Physiological research 55(4): 389-396, 2006
• [37] POGOSYAN AS, VENEDIKTOVA NI, KOSENKO EA, KAMINSKII YG: Antioxidant status of erythrocytes after acupuncture treatment. Bull Exp Biol Med. 138(1): 26-9, 2004.
• [38] MÜNZEL T, WENZEL P AND DAIBER A: Do We Still Need Organic Nitrates? Journal of the American College of Cardiology: 49(12): 1296-1298, 2007.
• [39] GIBBONS RJ, ABRAMS J AND CHATTERJEE K et al.: ACC/AHA 2002 guideline update for the management of patients with chronic stable angina—summary article: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee on the Management of Patients With Chronic Stable Angina). J Am Coll Cardiol 41: 159–168, 2003.