Regulacija ekspresije gena
Sadržaj
- 1 Uvod
- 2 Regulacija genske aktivnosti na molekulima DNA
- 3 Transkripciona kontrola
- 4 Kontrola obrade primarnog RNA transkripta
- 5 Kontrola transporta iRNA
- 6 Kontrola translacije
- 7 Kotrola degradacije iRNA
- 8 Kontola aktivnosti proteina
- 9 Kombinatorna kontrola ekspresije genoma
- 10 Determinacija i diferencijacija embrionalnih ćelija
- 11 Literatura
Uvod
Svaki živi organizam u svojim ćelijama sadrži molekule DNA (ili RNA) , takozvane nosioce genetskih informacija. Zbog čega su geni bitni za organizam, odnosno kakva je njihova uloga? Poznato je da su krajnji produkti ekspresije gena proteini. Od molekula DNA pa do proteina postoji mnogo nivoa i svaki od tih nivoa je pod strogom kontrolom. Prema tome možemo reći da postoje određeni nivoi kontrole ekspresije genoma (slika 1), kao što su:
- regulacija genske aktivnosti na molekulima DNA
- transkripciona kontrola
- kontrola obrade primarnog RNA transkripta
- kontrola transporta iRNA iz jedra u citoplazmu
- kontrola translacije
- kontrola degradacije iRNA u citoplazmi
- kontrola aktivnosti sintetisanih proteina i njihova posttranslaciona modifikacija
Regulacija genske aktivnosti na molekulima DNA
Hemijske promene DNA
Reverzibilne ili trajne hemijske promene baza DNA menjaju aktivnost gena. Tako stepen metilacije DNA utiče na aktivnost gena. Na ćelijama kunića je ustanovljeno da je u ćelijama koje sintetišu hemoglobin, DNA u blizini gena za beta globin nemetilirana ili vrlo malo metilirana, a u ćelijama mozga je metilacija potpuna (100% citozina je metilirano). Metilacija znači neaktivnost gena. Ovaj proces je reverzibilan, regulisan metilazama i demetilazama pa je pretpostavka da bi selektivna metilacija i demetilacija citozina mogla da predstavlja jedan oblik regulacije, tim pre jer je ustanovljeno da različita tkiva imaju specifične demetilaze. Radovi na embrionima sisara su pokazali da je DNA blastomera na ranim stupnjevima brazdanja maksimalno metilirana. Nešto kasnije počinje demetilacija u ćelijama trofoblasta (prvi se diferencira i omogućava implantaciju ploda), a potom i u ostalim ćelijama embriona.
Eliminacija ili gubitak genetskog materijala
Ovaj mehanizam regulacije je opisan kod procesa diferencijacije u somatskim ćelijama valjkastih crva, Nematodes. Zapaženo je da se tokom razvića Ascarisa deo citoplazme zigota sa mnogo RNA uvek nalazi samo u jednoj blastomeri. Blastomera bogata RNA ima 2n hromozoma. Sve ostale blastomere već posle prve deobe dobijaju fragmentisane hromozome, odnosno imaju manje DNA od 2n. Ćelije sa fragmentisanim hromozomima će se diferencirati u somatske ćelije, a ćelije sa 2n hromozoma daju ćelijsku liniju gonocita. Ovaj mehanizam je opisan kod Nematodes, nekih protozoa i insekata, a nema podataka da bi funkcionisao kod sisara.
Amplifikacija ili selektivno umnožavanje gena
Selektivno umnožavanje gena omogućava ćeliji da u određenom trenutku obezbedi veliki broj potrebnih molekula. Kod malignih obolenja usled izmenjene regulacije u samoj ćeliji može da dođe do nekontrolisanog umnožavanja određenih segmenata hromozoma kao što su nezavisni mali fragmenti DM (double minutes) ili HSR. Amplifikacija se dešava i u ovocitama Xenopusa. U mladim ovocitama vrste Xenopus laevis (Amfibia) u stadijumu pahitena jedro ima dve vrste DNA: rastresitu, hromozomsku DNA i kompaktnu rDNA. Ribozomska DNA sadrži gene za prekusorsku,45s RNA. U ovocitu ima 100-1000 puta gena za rRNA nego u somatskim ćelijama. Povećanje gena za rRNA vrši se procesom amplifikacije pri čemu se hromozomi ne replikuju. Zahvaljujući ovakvom povećanju broja gena za rRNA, jedan ovocit može da sintetiše toliko rRNA koliko u istom vremenskom periodu sintetiše 20 000 ćelije jetre.
Prerasporedela genetičkog materijala
Predstavlja preraspodelu nukleotida i za sada je poznato da se to dešava samo kod ćelija koja produkuju antitela. Molekuli imunoglobulina se sastoje od dva identična teška (H) lanca i dva identična laka (L) lanca. Ovi lanci su povezani disulfidnim vezama. Svaki imunoglobulin ima 3 regiona, varijabilni (V) region koji se vezuje sa antigenom i konstantni (C) region koji se ne povezuje sa antigenom. Ova dava dela spaja J (junction) region. Svaki polipeptidni lanac imunoglobulina kontrolišu dva različita strukturna gena: gen V i gen C. V i C geni se nalaze kod čoveka na hromozomu 2, 14 i 22. Npr. na hromozomu 22 se nalaze geni za regione CL i varijabilni region lambda lanca. Ova dva gena se nalaze na odredjenom odstojanju. Da bi došlo do stvaranja imunoglobulina ovi geni moraju biti kontinuirani. Na osnovu eksperimentalnih podataka skporo je sigurno da se spajanje gena V i C obavlja na nivou DNA molekula. Tonegawa je prvi pokazao da su geni za V i C deo imunoglobulina odvojeni u germinaivnim ćelijama, dok su kontinuirani u ćelijama koje produkuju antitela. To bi značilo da se u toku diferenciranja B-ćelija dešava proces ireverzibilne rekombinacije DNA, odnosno javlja se delecija segmenata izmedju V i C gena, čime oni bivaju spojeni.
Organizacija hromozoma
Eukariotska DNA je čvrsto vezana za histone gradeći nukleozome, a hromatinske niti su višestruko spiralizovane, tako da je DNA potpuno nedostupna RNA polimerazi i drugim enzimima transkripcionog aparata. Da bi neki region hromatina mogao biti transkribovan neophodno je da prvo bude dekondezovan. Eksperimentima je pokazano da u hromatinu postoje mesta koja su veoma osetljiva na delovanje DNA-ze I. To su tzv. hipersenzitivna mesta. Ona se nalaze uglavnom u promotorskim regionima gena koji se mogu transkribovati ili se trenutno transkribuju, kao i u regionima DNA odgovornim za inicijaciju replikacije i rekombinacije. U hipersenzitivnim mestima je omogućen pristup regulatornim proteinima i RNA polimerazi do regulatornih nizova nukleotida u DNA da bi transkripcija mogla da započne. U hipersenzitivnim mestima nema histona. Ona nastaju vezivanjem proteina koji specifično prepoznaju određene redoslede nukleotida u DNA i izmeštaju nukleozome tako što onemogućavaju vezivaje histona za DNA, olakšavajući inicijaciju transkripcije. Dva najvažnija načina za lokalno menjanje hromatinske strukture su kovalentna modifikacija histona i remodelovanje nukleozoma.
Kovalentna modifikacija histona
Gen aktivator proteini vezuju se za histon acetil transferazu (HATs), koja je poznata kao histon acetilaza. To je ATP-zavisan kompleks za remodelovanje hromozoma. Zahvaljujući hemijskim promenama histona, acetilaciji, oni se razdvajaju od molekula DNA. Na taj način je izvršeno remodelovanje hromozoma i omogućen pristup RNA polimerazi i transkripcija može da počne (slika 2).
Transkripciona kontrola
Transkripciona kontrola je od najvećeg značaja za većinu gena jer od nje zavisi koji će se geni prepisivati, a koji ne. Ključno mesto u regulaciji transkripcije zauzimaju gen-regulatorni proteini.
Gen-regulatorni proteini
Od gen-regulatornih proteina zavisi da li će se gen aktivirati ili inhibirati. Gen-regulatorni proteini se vezuju za specifične sekvence DNA duzine od 8-15 nukleotida i na taj način aktiviraju ili inhibiraju transkripciju (slika 3). Najčešće nekoliko gen-regulatornih proteina učestvuje u aktivnosti jednog gena. Čak je i kod bakterija potrebna interakcija bar dva različita regulatorna proteina da bi se promenila aktivnost gena, dok kod eukariota čitava grupa gen-regulatornih proteina deluje zajednički da bi se odredilo da li će doći do transkripcije. Jedan isti gen-regulatortni protein može modulirati sintezu različitih grupa enzima u različitim tipovima ćelija. Na taj način jedan gen-regulatorni protein ima različite funkcije u zavisnosti sa kojim će se proteinima kombinovati. Npr. receptor za steroidni hormon modulira sintezu različitih grupa enzima u različitim tipovima ćelija. To zavisi od gen-regulatornih proteina koji su bili prisutni u ćeliji pre sinteze steroidnog receptora. Kombinacija nekoliko gen-regulatornih proteina rezultuje pojavom velikog broja ćelijskih tipova -KOMBINATORNA REGULACIJA GENA. Npr. 25 različitih gen-regulatornih proteina može teoretski odrediti više od 10.000 tipova ćelija. Iz tog razloga se oni u ćeliji nalaze u malim količinama. Postoje gen-regulatorni proteini koji imaju odlučujuću ulogu u koordinaciji ostalih regulatornih proteina tj. kontrolišu aktivnost mnogih drugih gena. Na primer odsustvo receptora za testosteron dovodi do toga da se muški genotip (XY) razvije kao ženski. Znači jedan jedini protein može odrediti tip ćelije (ključni ili master gen-regulatorni proteini).
Sinteza gen-regulatornih proteina
Za sintezu gen regulatornih proteina su odgovorni liposolubilni hormoni koji lako prolaze kroz ćelijsku membranu. Receptori za ove hormone se nalaze u citosolu i imaju veliki afinitet prema njima. Vezivanje hormona za receptore izaziva konformacione promene u njihovoj strukturi što uslovljava aktivaciju receptora i povećanja afiniteta za određene sekvence DNA. To su gen-regulatorne sekvence i one su pod kontrolom steroidnih hormona. Sekvenca koja prepoznaje kompleks hormon-receptor ima funkcije ENHENSERA za gen čiju aktivnost reguliše steroidni hormon. Vezivanje kompleksa hormon-receptor za DNA ima primaran i sekundaran odgovor. Primaran odgovor je sinteza gen-regulatornih proteina, a sekundaran odgovor je uticaj tog gen-regulatornog proteina na druge gene. Sekundaran odgovor moze biti i prekid sinteze gen-regulatornih proteina i to je takozvana FEEDBACK KONTROLA. Primer sekundarnog odgovora je efekat koji hormon kortizol ima na druge gene. On uključuje gene samo u ćelijama koje sadrže kortizolske receptore koje, opet, uključuju neki drugi prekidači. Geni koje uključuje kortizol zauzvrat uključuju druge gene, a ti drugi ponekad uključuju još neke gene i tako dalje. Glavna svrha većine gena u ljudskom genomu da regulišu ekspresiju drugih gena u genomu. Zanimljivo je to da isti receptori steroidnih hormona regulišu različite gene u različitim ćelijama. Razlog tome je što se više od jedne vrste gen-regulatornih proteina mora vezati za regulatorne sekvence eukariotskog organizma da bi aktivirao njegovu transkripciju. Prema tome svaki steroidni hormon ima karakteristične fiziološke efekte, jer samo određene ćelije sadrže receptor za njega i što svaki od tih tipova ćelija sadrži različite kombinacije gen-regulatornih proteina.
Kontrola obrade primarnog RNA transkripta
Iako je kontrola inicijacije najbitnija za regulaciju mnogih gena, u kontroli ekspresije genoma su bitni i drugi nivoi. Ova kontrola podrazumeva obradu RNA transkripta. Primarna struktura primarnog RNA transkripta je komplementarna primarnoj strukturi DNA matrice sa koje se sintetisao RNA. Jedina razlika je sto RNA molekuli umesto timina (T) sadrze uracil (U). Poznato je da eukarioti u svojoj DNA matrici sadrze i nekodirajuće sekvence, koje se prepisivanjem prenose na RNA. Obrada primarnog RNA transkripta podrazumeva splicing (isecanje nekodirajućih sekvenci tj. Introna) capping i polyadenilaciju.
Obrada primarnih transkripata kovalentnim modifikacijama
Pre svega 5’ kraj molekula RNA koji se sintetiše u procesu transkripcije se modifikuje najčesce još dok transkripcija nije završena tako što mu se dodaje 7-metil-guanozin koji se vezuje 5’-5’trifosfatnim mostom za prvi ribonukleotid u nizu. Uz to, metiluje se 2’ hidroksilna grupa prve, a ponekad i druge riboze u nizu. Tako, transkript na svom 5’ kraju dobija strukturu koja je poznata kao 5’ kapa (Slika 4). Primarni transkript postaje pozitivan zbog metil grupe. Kapa na 5’ kraju je veoma bitna za vezivanje ribozoma za iRNA u procesu translacije. Uklanjanje 5’ kape dovodi do ubrzane degradacije iRNA u citoplazmi. U ćeliji postoje određeni regulatorni mehanizmi koji dodavanjem ili uklanjanjem 5’ kape utiču na intezitet translacije.
Na 3’ kraju primarnog transkripta takođe se vrši obrada. Ova obrada podrazumeva dodavanje niza od 100-200 ostataka adeninskih nukleotida na 3’ kraj primarnog transkripta (slika 5). To je takozvani 3’-poli(A) rep. Poliadenilaciju primarnog transkripta katalizuje enzim poli (A) polimeraza, a proces se odvija u dve faze. Mesto na kom počinje poliadenilacija nastaje terminacijom transkripcije. U eukariotskim ćelijama signal za poliadenilaciju je evolutivno očuvani niz AAUAAA. Kada se transkripcija završi, endonukleaza hidrolizuje primarni transkript na mestu 15 nukleotida nizvodno od signala za poliadenilaciju, a zatim poli(A) polimeraza dodaje poli(A) rep na novonastali 3’ kraj transkripta, katalizujući polimerizaciju ATP-a praćenu hidrolizom pirofosfata. Funkcija poli(A) repa još nije dovoljno poznata. Zna se da se u citoplazmi za njega vezuju proteini koji pakuju iRNA u RNP čestice štiteći ih od degradacije. Moguće je da je poli(A) rep važan i za splicing.
Obrada transkripata isecanjem introna
Primarni transkript RNA je nestabilan i samo mali njegov deo izbegne degradaciju. Eksperimentalni podaci su pokazali da se dužina novosintetisane RNA brzo smanjuje , tako da se za 30 min svede na dužinu citoplazmatične iRNA. U proseku primarni transkript sadrži oko 6000 nukleotida , a iRNA oko 1500 nukleotida. Ovo je ukazalo da postoji bitna razlika između prokariotskih i eukariotskih organizama. Kod prokarita nema naknadne obrade primarnog transkripta jer on sadrži kontinuirani niz nukleotida koji je šifra za sintezu proteina. Eukariotski primarni transkript sadrži nekodirajuće sekvence koje su kopije introna. Te sekvence se moraju iseći iz primarnog transkripta da bi nastale iRNA koje će kodirati proteine (slika 6). Eukariotski primarni transkript podleže obradi koja se sastoji od isecanja introna i predstavlja pored transkripcije i translacije još jedan korak u kome je moguće uticati na končanu ekspresiju gena.
Kontrola transporta iRNA
Kontrola transporta iRNA obuhvata mehanizme koji određuju koje zrele iRNA će se transportovati iz jedra u citoplazmu, pri čemu samo oko 5% od svih zrelih iRNA dospeva u citoplazmu. U ćeliji, RNA je od samog poćetka sinteze, pa sve do kraja svog životnog veka vezana za proteine za ribonukleoproteinske komplekse – RNP. Mnogi od proteina iz ovih kompleksa su veoma očuvani u toku evolucije, što ukazuje na njihov univerzalni biološki značaj, koji se po svemu sudeći, sastoji upravo u regulaciji transporta iRNA iz jedra u citoplazmu i njihove stabilnosti.
Kontrola translacije
Translacija (biosinteza proteina) obuhvata tri osnovne faze kontrolisane grupom različitih translacionih faktora.
- Inicijacija
Kod prokariota učestvuju tri inicijaciona faktora. Kao i ostali proteinski faktori translacije oni spadaju u kategoriju uslovno ribozomskih proteina, jer su vezani za ribozome samo u toku određenih faza translacije. U toku vezivanja velike subjedinice ribozoma za 30S inicijacioni kompleks inicijacioni faktori disosuju i više nemaju nikakvog uticaja na proces elongacije polipeptidnog lanca. Ta tri faktora su: IF-1 čija uloga još uvek nije sasvim jasna. Smatra se da on potpomaže delovanje IF-3, a pored toga da ima važnu ulogu u oslobađanju IF-2. IF-2 učestvuje u vezivanju inicijatorske tRNA za nekomplementarno P mesto na 30S subjedinici. On formira kompleks isključivo sa fMet-tRNA i na taj način obezbeđuje da samo inicijatorska tRNA može da učestvuje u inicijaciji. Pored toga on dovodi i do hidrolize GTP-a. IF-3 ima dvostruku ulogu: neophodan je za vezivanje male subjedinice za određeno mesto na iRNA i učestvuje u disacocijaciji ribozoma na subjedinice tj. kontroliše količinu slobodnih 30S subjedinica. Kod eukariota inicijacioni faktori su brojniji i kompleksniji nego kod prokariota iako obavljaju iste osnovne funkcije. Do sada je identifikovano više od 10 različitih inicijacionih faktora. Međutim, najbolje proučen faktor inicijacije kod eukariota je eIF-2 koji vezuje GTP, a zajedno sa njim i Met-tRNA.
- Elongacija
Vezivanje aminoacil-tRNA se odvija uz pomoć elongacionog faktora EF-T kod prokariota, odnosno EF-1 kod eukariota. Ovaj faktor je vezan za ribozom samo do trenutka dok se aminoacil-tRNA ne veže za A mesto, a zatim odmah napušta ribozom i vezuje se za drugu aminoacil-tRNA. U drugoj fazi, vezivanje kompleksa elongacionog faktora EF-G sa GTP-om dovodi do toga da se tRNA zajedno sa iRNA pomere u odnosu na malu subjedinicu tako da se peptidil-tRNA nađe u P mestu na obe subjedinice ribozoma, a deacilovana tRNA u E mestu na velikoj subjedinici. Interesantno je da ribozomi ne može da veže istovremeno i EF-T i EF-G tako da se elongacija odvija uz alternativno vezivanje i oslobađanje ovih faktora.
- Terminacija
Kada se jedan od stop kodona (UAA, UAG ili UGA) nađe u A mestu za njega se vezuje protein nazvan terminacionim faktorom. Kod prokariota postoje tri terminaciona faktora: RF-1, RF-2, RF-3. RF-1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG, RF-2 prepoznaje UAA i UGA, a RF-3 vezuje GTP i stimuliše aktivnost prva dva faktora. Kod eukariota postoji samo jedan faktor terminacije označen kao eRF.
Kotrola degradacije iRNA
Neke RNA opstaju satima ili danima dok se druge degradiraju već pola sata pošto su dospele u citoplazmu. Na stabilnost iRNA utiče poli-A rep na 3'-kraju koji sadrže skoro sve eukariotske iRNA. takođe na iRNA utiče i karakterističan niz nukleotida u 3' nekodirajućem delu iRNA u kome se često nalazi duplet AU koji utiče na ubrzanu degradaciju. U nekim slučajevima, degradacija iRNA je kontrolisana hormonima, tako da u zavisnosti od hormonskog statusa životinje jedna ista iRNA može imati različit poluživot.
Kontola aktivnosti proteina
Obuhvata posttranslacionu kontrolu tj. mehanizme za kovalentnu modifikaciju sintetisanih proteina i njihovog prevođenja u biološki aktivan oblik (slika 7). Najzastupljeniji tip je proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (formilmetionina) sa NH2-kraja polipeptida Česta modifikacija je i ograničena proteoliza tokom koje se inaktivni proteinski prekursori uklanjanjem određenih oligopeptida ili polipeptida prevode u aktivne proteine. Mnogi transmembranski i proteini namenjeni sekreciji sintetišu se sa tzv. signalnim peptidima na NH2-kraju koje uklanjaju specifične peptidaze. Poznato je takođe više od 150 različitih kovalentnih modifikacija aminokiselinskih bočnih grupa od kojih su najčešće: fosforilacije, acetilacija, glikozilacija, hidroksilacija i metilacija. Posttranslacione modifikacije proteina uključuju i vezivanje koenzima za proteinske komponente enzima. Ove modifikacije su ireverzibilne.
Kombinatorna kontrola ekspresije genoma
Genom sadrži sve informcije potrebne za rast, razvice i funkcionalnu specifikaciju. U svakoj ćeliji nekog multicelularnog organizma se nalazi ista količina genetskog materijala čija je primarna struktura identična. To je potvrđeno mnogim eksperimentima. Ako se mikropipetom iz oplođene jajne ćelije žabe izvadi jedro, pa se u ovakvu enukleiranu ćeliju unese jedro neke od ćelija blastul ili gastrule, u najvećem broju eksperimenata jajna ćelija počinje da se brazda i normalno se razvija (slika 8).
Ovim eksperimentom je dokazano da sve ćelije sadrze istu DNA , ali kako se onda u tom organizmu javlja više tipova ćelija koje imaju različit put razvoja, različitu morfologiju i funkciju? Pre nego sto je dokazano da sve ćelije sadrze istu DNA , smatralo se da se pri razvoju organizma u ćelijama gube geni i da iz toga proizilazi razlicita morfologija i funkcija ćelija jednog organizma. Sada se zna da se geni selektivno ekspresuju i da se ne gube u toku razvoja i diferencijacije ćelije. Da regulacija ekspresije gena zaista postoji može se dokazati poređenjem kompozicije proteina u razlicitim tipovma ćelija istog organizma. Ćelije mozga, epidermisa, mišićne i dr. ćelije sadrze u sebi različite proteine iako imaju identicne molekule DNA, sa naravno identicnim genomom. Kako su proteini produkti ekspresije gena, iz ovoga se može zaključiti da se u svim celijama ne ekspresuju isti geni. Naravno, postoje mnogi proteini koji se nalaze u različitim ćelijama istog organizma. To su proteini koji se sintetišu sa KONSTITUTIVNIH GENA tj. gena koji su uvek aktivirani. Na primer to su geni sa kojih se sintetisu gen-regulatorni proteini . Mnogi ćelijski procesi su slični u različitim tipovima ćelija. U svakoj ćeliji postoji mala količina specijalizovanih proteina, koji tu ćeliju čini drugacijom od ostalih. Ovi proteini se sintetisu sa INDUCIBILNIH GENA koji se aktiviraju samo ponekad i to u prisustvu specifičnih jedinjenja ili induktora.Tipična sisarska ćelija ekspresuje oko 10 000 gena od postojećih 60 000 gena. Znači, upravo ta ekspresija različitih setova gena u svakoj ćeliji dovodi do razlike u velicini, obliku i funkciji potpuno diferenciranih ćelija organizma. Kako dolazi do kontrole ekspresije gena??? Na primer, kod čoveka postoji 250 osnovnih tipova ćelija. Dolazi se do zaključka da su u različitim ćelijama aktivirani različiti geni, i da postoje određeni načini regulacije genomske aktivnosti. Postoji jasna razlika između kontrole ekspresije gena kod jednoćelijskih i visećelijskih organizama. Kod jednoćelijskih organizama aktivnost gena zavisi od spoljasnje sredine (hranljivi sastav) tj ćelija se prilagođava promenama u spoljašnjoj sredini . Kod multicelularnih organizama način regulacije ekspresije gena je u funkciji razvoja organizma kao celine tj difrencijacije ćelije. Bitna stvar u vezi ekspresije genoma je da ona zavisi u velikoj meri od vrste organizma, pola i stadijuma razvoja. To je činjenica na kojoj se zasniva kombinatorna kontrola ekspresije genoma. Kombinacija vise gen-regulatornih proteina , a ne jednog gen-regulatornog proteina, utiče na to koji deo DNA i kada ce se transkribovati. Kao primer kombinatorne kontrole genoma može se uzeti diferencijacija mišićne ćelije. Familija miogenih proteina (MioD, Mzf5, miogenin i Mrf4) je normalno prisutna u mišićnim ćelijama. Ovi proteini utiču na aktivaciju mišicno specifičnih strukturnih gena. Ako se ukloni miogenin ćelija se nece diferencirati, ali ako se u fibriblastu ponovo aktivira gen za miogenin, on će se pretvoriti u mišićnu ćeliju. Međutim, drugi ćelijski tipovi se neće diferencirati u mišićnu ćeliju pomoću miogenin proteina. To nagoveštava da te ćelije u sebi nemaju neke druge proteine koji su zajedno sa miogeninom potrebni za diferencijaciju u mišićnu ćeliju. Multipli gen-regulatorni proteini mogu učestvovati u regulaciji ekspresije pojedinih gena, ipak, kombinatorna kontrola ekspresije gena znači više, odnosno nema svaki gen svoje multiple gen-regulatorne proteine, već svaki regulatorni protein ima svoj doprinos u kontroli ekspresije mnogih gena. Mada neki gen-regulatorni proteini kao MioD ili miogenin su specifični za specifične tipove ćelija. Jedan sam gen-regulatorni protein nema određenu funkcju. On tek zajedno sa nekim drugim regulatornim proteinima utiče na aktivnost gena. Tako da dodavanje novog gen-regulatornog proteina u ćeliju može, ali ne mora imati posledice , što zavisi od istorije ćelije odnosno od regulatornih proteina koji se već nalaze u njoj (slika 9).
Diferencijalna genska ekspresija je ključna komponenta mnogih fenomena koji ukljucuju ćelijski razvoj i diferencijaciju, ćelijsko odrzavanje kao i ćelijsku smrt. Činjenica je da skup gena koji se ekspresuju određuju fenotip ćelije. Takođe gubitak nad kontrolom sinteze regulatornih proteina odnosno gubitak kontrole diferencijacije ćelije moze dovesti do velikog broja bolesnih stanja ćelije kao sto je naprimer cancer (rak). Identifikacija genskih produkata koji se ekspresuju u jednom tipu ćelije nasuprot genskih produkata koji se ekspresuju u drugom tipu celije ,moze pomoci u objasnjavanju funkcije tih gena. Takođe tako se dobija slika stanja o tome šta se trenutno dešava u toj ćeliji. Iz tih razloga identifikacija diferencijalno ekspresovanih gena je bitna jer se iz toga može videti kako ćelija reaguje na različite stimuluse kao sto su hormoni , hemijski agensi, X zraci itd.
Determinacija i diferencijacija embrionalnih ćelija
Život svake višećelijske jedinke, kao što je rečeno počinje jednom jedinom, oplođenom jajnom ćelijom, zigotom. U genomu zigota je upisan razvojni plan novog organizma koji treba da se realizuje tokom embrionalnog i fetalnog perioda. Embrion se razvija iz zigota dugim i slozenim procesima, od kojih su najznačajniji proliferacija ćelija (rast), diferencijacija ćelije i oblikovanje nove jedinke, morfogeneze. Morfogeneza je uslovljena rastom i diferencijacijom. Centralni problem biologije razvića je pitanje: kako od jedne ćelije, nastaje složeni organizam od nekoliko milijardi ćelija? Sve te ćelije nastaju od zigota. Zigot je totipotentan. Sa svakom novom deobom potencije blastomera se ograničavaju (pluriporentnost, multipotentnost) da bi se, ranije ili kasnije definitivno svele nan jedan jedini razvojni put-embrionalne ćelije postaju unipotentne. Osnovna razlika među diferenciranim ćelijama je u biosintezi specifičnih proteina tj. diferencirana ćelija je specifična po tipu proteina koji proizvodi i po ulozi koju ima u organizmu. Ako se tokom razvića jedra kvalitativno ne menjaju, zašto ipak dolazi do diferencijacije, do nastajanja razlika između embrionalnih ćelija? Važna komponenta jajne ćelije je citoplazma. U mnogim jajnim ćelijama, neposredno po oplođenju, mogu da se uoče kvalitativno različiti predeli citoplazme. To je MATERINSKI EFEKAT. Ti predeli se razlikuju po konzistenciji citoplazme, po prisustvu ili odsustvu različitih inkluzija, po količini RNA, rasporedu organela, biohemijskim procesima i dr. Znači citoplazma jajne ćelije nije uniformna, ona sadrži miks gen-regulatornih proteina koji su nejednako raspoređeni duž embriona. Svojstvo potomka je rezultat dejstva majčinskih nuklearnih gena koji se u vidu iRNA ili proteina nalaze u oociti i imaju dejstvo posle oplodnje. Faktori koji se nalaze u citoplazmi usmeravaju neke od procesa u embriogenezi, modifikujući ili potpuno maskirajući informacije koje se nalaze u genomu samog embriona. U toku brazdanja, sa svakom novom deobom, embrionalne ćelije postaju sve manje i manje i ne menjaju svoj polozaj u odnosu na predele zigota. To znači da od početka brazdanja blastomere dobijaju kvalitativno različitu citoplazmu. Citplazma predstavlja spoljašnju sredinu jedra i može da utiče na aktivnost jedra. To je dokazano eksperimentima. Ako se jedro diferencirane ćelije presadi u citoplazmu zigota, prestaje transkripcija RNA, karakteristična za diferenciranu ćeliju. Zaključak je da diferencijacija primarno zavisi od kvaliteta citolazme u kojoj se nalazi jedro. Veoma je zanimljivo da oplođena jajna ćelija kojoj je uklonjeno jedro može da se brazda, zavisno od vrste kojoj pripada, do blastule, gastrule pa čak i do larve. Ako je zigot bez jedra sposoban da de se brazda, onda moramo da predpostavimo da se u samoj citoplazmi zigota nalaze izvesne informacije koje obezbeđuju brazdanje. Te informacije mora da potiču od genoma jer se i zigot bez jedra brazda po određenom nasleđenom planu, na određen nasledan način.
Embrionalno razviće kod Drosophila melanogaster
Embrion Drosophile u ranom razviću ima malo ćelija koje se nalaze u vidu sincicijuma koji se sasrtoji od citplazmi i jedara. Citoplazma jajne ćelije nije uniformna, ona sadrži miks gen-regulatornih proteina koji su nejednako raspoređeni duž embriona. Ovakva struktura održava se kroz ćelijske deobe sve dok ne bude proizvedeno 1500 jedara. Nakon toga počinje da se obrazuje sa spoljažnje strane sincicijuma blastoderm. U toku brazdanja, sa svakom novom deobom, embrionalne ćelije postaju sve manje i manje i ne menjaju svoj polozaj u odnosu na predele zigota. To znači da od početka brazdanja blastomere dobijaju kvalitativno različitu citoplazmu. Geni koji kontrolišu proces embrionalnog razvića zovu se homeotski geni. Oni deluju na principu da jedan gen uključuje drugi , a ovaj uključuje naredni. Primer ovakvo multigenetičkog prekidaca se može opisati kod Drosophile. Geni za razviće deluju hijerarhijski, deleći embrion u sve manje regione, da bi stvorili što više detalja. Kod Drosophile se na istom hromozomu nalazi grupacija od osam homeotskih gena i oni su poznati kao Hox geni (slika 10). Svaki od tih osam gena utiče na različiti deo mušice. Veoma zanimljivo je da su geni poređani istim redosledom kao i delivi tela na koji utiču. Prvi gen utiče na usta, drugi na lice, treći na vrh glave, četvrti na vrat, peti na grudni koš, šesti na prednju polovinu abdomena, sedmi na zadnju polovinu abdomena i osmi na razne druge delove abdomena. I ne samo da prvi gen definiše prednji deo, a poslednji zadnji deo tela mušice, nego su svi, bez izuzetka istim redosledom povezani duž hromozoma. Zajednička stvar za sve homeotske gene ja da svi u sebi sadrže deo lanca sa istim redosledom nukleotida (180 bp) poznat kao homeoboks. Ako svih 8 gena sadrži istu sekvencu nukleotida, šta je to što odredjuje diferencijaciju dela tela? Homeoboks je deo gena pomoću koga se protein iz citoplazme jajne ćelije vezuje za DNA da bi uključio ili isključio drugi gen. Svi homeotski geni su geni za uključivanje ili isključivanje drugih gena. Idući od glave ka zadnjem delu tela, geni se uključuju jedan za drugim i svaki novi gen preobražava taj deo embriona u sledeći deo tela.
Sve proističe iz osnovne asimetrije hemikalija koje se nalaze u jajetu. Ustanovljeno je da miševi imaju takođe grupacije Hox gena i to četiri. Oni su takođe poređani određenim redosledom-prvo za glavu, a na kraju za rep. Hox geni miševa imaju skoro identičan homeobox kao i vinska mušica. Ljudska bića imaju potpuno iste Hox grupacije kao miševi. Sličnost među genima je toliko velika da su naučnici uradili neverovatan eksperiment. Namerno mutirani neki gen mušice su nokautirali i tehnikom genetičkog inženjeringa zamenili ekvivalentnim genom čoveka i odgojili normalnu mušicu. Uključivanjem i iskljucivanjem gena blastomere dobijaju različite proteine. Tako blastomere na prednjem delu embriona sadrže cipolazmu bogatu proteinom bicoid, na zadnjem nanos, a hunchback i caudal su raspoređeni ravnomerno po citiplazmi i deluju posredstvom predhodna dva. Bicoid aktivira hunchback gene što uslovljava povećavanje koncentracije njegovih proteina, a što smanjuje stvaranje proteina caudal gena, odnosno inhibira translaciju caudal iRNA. Nanos suzbija translaciju hunchback iRNA što doprinosi daljem raspoređivanju hunchback proteina. Krajnji rezultat je veća koncentracija bicoid i hunchback-a u prednjem delu, a nanos-a i caudal-a u zadnjem delu. Tu se uključuje i protein torzo i još jedan protein gena materinskog efekta koji se akumulira na krajevima prednjeg i zadnjeg dela embriona. Slični procesi odvijaju se i u uspostavljanju dorzalno-ventralnog gradijenta gde dominira protein dorsal (slika 11).
Literatura
- www.findology.com
- www.dev-biologie.de/versuche/ embryo/fotoembryo.ht
- www.csu.edu.au/faculty/health/biomed/subjects/ molbol
- Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts , The Art * Of Molecular Biology of the Cell – fourth edition, 2000.
- Dr.Gordana Matić, Osnovi molekularne biologije, Beograd, 1997.
- D. Marinković, N. Kekić, N. Tucić, Genetika, šesto izdanje, Beograd 1991.
- Zoran L. Kovačević , Biohemija i molekularna genetika, Novi Sad, 1999.
- Met Ridli, Genom-autobiografija vrste u 23 poglavlja, Plato Beograd, 2001.
- Jovan Anđić, Osnovi medicinske biohemije, Naučna knjiga, Beograd, 1999.
- R. K. Anđus ,Opšta fiziologija i biofizika-jonski kanali, Beograd, 2001.
- D. Kovačević, G. Bjelaković, V.B.Đorđević, J. Nikolić, D. D. Pavlović, G. Kocić, Biohemija, Savremena administracija, Beograd, 1996.
- V. Diklić, M. kosanović, J. Nikoliš, S. Dukić, Biologija sa humanom genetikom, reprint izdanja 1997, Grafopan, Beograd, 2001.
- Lj. Vapa, D. Obreht, Genetika kroz primere i zadatke, Novi Sad, 2003.
