Regulacija ekspresije gena
Sadržaj
Uvod
Svaki živi organizam u svojim ćelijama sadrži molekule DNA (ili RNA) , takozvane nosioce genetskih informacija. Zbog čega su geni bitni za organizam, odnosno kakva je njihova uloga? Poznato je da su krajnji produkti ekspresije gena proteini. Od molekula DNA pa do proteina postoji mnogo nivoa i svaki od tih nivoa je pod strogom kontrolom. Prema tome možemo reći da postoje određeni nivoi kontrole ekspresije genoma (slika 1), kao što su:
- regulacija genske aktivnosti na molekulima DNA
- transkripciona kontrola
- kontrola obrade primarnog RNA transkripta
- kontrola transporta iRNA iz jedra u citoplazmu
- kontrola translacije
- kontrola degradacije iRNA u citoplazmi
- kontrola aktivnosti sintetisanih proteina i njihova posttranslaciona modifikacija
Regulacija genske aktivnosti na molekulima DNA
Hemijske promene DNA
Reverzibilne ili trajne hemijske promene baza DNA menjaju aktivnost gena. Tako stepen metilacije DNA utiče na aktivnost gena. Na ćelijama kunića je ustanovljeno da je u ćelijama koje sintetišu hemoglobin, DNA u blizini gena za beta globin nemetilirana ili vrlo malo metilirana, a u ćelijama mozga je metilacija potpuna (100% citozina je metilirano). Metilacija znači neaktivnost gena. Ovaj proces je reverzibilan, regulisan metilazama i demetilazama pa je pretpostavka da bi selektivna metilacija i demetilacija citozina mogla da predstavlja jedan oblik regulacije, tim pre jer je ustanovljeno da različita tkiva imaju specifične demetilaze. Radovi na embrionima sisara su pokazali da je DNA blastomera na ranim stupnjevima brazdanja maksimalno metilirana. Nešto kasnije počinje demetilacija u ćelijama trofoblasta (prvi se diferencira i omogućava implantaciju ploda), a potom i u ostalim ćelijama embriona.
Eliminacija ili gubitak genetskog materijala
Ovaj mehanizam regulacije je opisan kod procesa diferencijacije u somatskim ćelijama valjkastih crva, Nematodes. Zapaženo je da se tokom razvića Ascarisa deo citoplazme zigota sa mnogo RNA uvek nalazi samo u jednoj blastomeri. Blastomera bogata RNA ima 2n hromozoma. Sve ostale blastomere već posle prve deobe dobijaju fragmentisane hromozome, odnosno imaju manje DNA od 2n. Ćelije sa fragmentisanim hromozomima će se diferencirati u somatske ćelije, a ćelije sa 2n hromozoma daju ćelijsku liniju gonocita. Ovaj mehanizam je opisan kod Nematodes, nekih protozoa i insekata, a nema podataka da bi funkcionisao kod sisara.
Amplifikacija ili selektivno umnožavanje gena
Selektivno umnožavanje gena omogućava ćeliji da u određenom trenutku obezbedi veliki broj potrebnih molekula. Kod malignih obolenja usled izmenjene regulacije u samoj ćeliji može da dođe do nekontrolisanog umnožavanja određenih segmenata hromozoma kao što su nezavisni mali fragmenti DM (double minutes) ili HSR. Amplifikacija se dešava i u ovocitama Xenopusa. U mladim ovocitama vrste Xenopus laevis (Amfibia) u stadijumu pahitena jedro ima dve vrste DNA: rastresitu, hromozomsku DNA i kompaktnu rDNA. Ribozomska DNA sadrži gene za prekusorsku,45s RNA. U ovocitu ima 100-1000 puta gena za rRNA nego u somatskim ćelijama. Povećanje gena za rRNA vrši se procesom amplifikacije pri čemu se hromozomi ne replikuju. Zahvaljujući ovakvom povećanju broja gena za rRNA, jedan ovocit može da sintetiše toliko rRNA koliko u istom vremenskom periodu sintetiše 20 000 ćelije jetre.
Prerasporedela genetičkog materijala
Predstavlja preraspodelu nukleotida i za sada je poznato da se to dešava samo kod ćelija koja produkuju antitela. Molekuli imunoglobulina se sastoje od dva identična teška (H) lanca i dva identična laka (L) lanca. Ovi lanci su povezani disulfidnim vezama. Svaki imunoglobulin ima 3 regiona, varijabilni (V) region koji se vezuje sa antigenom i konstantni (C) region koji se ne povezuje sa antigenom. Ova dava dela spaja J (junction) region. Svaki polipeptidni lanac imunoglobulina kontrolišu dva različita strukturna gena: gen V i gen C. V i C geni se nalaze kod čoveka na hromozomu 2, 14 i 22. Npr. na hromozomu 22 se nalaze geni za regione CL i varijabilni region lambda lanca. Ova dva gena se nalaze na odredjenom odstojanju. Da bi došlo do stvaranja imunoglobulina ovi geni moraju biti kontinuirani. Na osnovu eksperimentalnih podataka skporo je sigurno da se spajanje gena V i C obavlja na nivou DNA molekula. Tonegawa je prvi pokazao da su geni za V i C deo imunoglobulina odvojeni u germinaivnim ćelijama, dok su kontinuirani u ćelijama koje produkuju antitela. To bi značilo da se u toku diferenciranja B-ćelija dešava proces ireverzibilne rekombinacije DNA, odnosno javlja se delecija segmenata izmedju V i C gena, čime oni bivaju spojeni.
Organizacija hromozoma
Eukariotska DNA je čvrsto vezana za histone gradeći nukleozome, a hromatinske niti su višestruko spiralizovane, tako da je DNA potpuno nedostupna RNA polimerazi i drugim enzimima transkripcionog aparata. Da bi neki region hromatina mogao biti transkribovan neophodno je da prvo bude dekondezovan. Eksperimentima je pokazano da u hromatinu postoje mesta koja su veoma osetljiva na delovanje DNA-ze I. To su tzv. hipersenzitivna mesta. Ona se nalaze uglavnom u promotorskim regionima gena koji se mogu transkribovati ili se trenutno transkribuju, kao i u regionima DNA odgovornim za inicijaciju replikacije i rekombinacije. U hipersenzitivnim mestima je omogućen pristup regulatornim proteinima i RNA polimerazi do regulatornih nizova nukleotida u DNA da bi transkripcija mogla da započne. U hipersenzitivnim mestima nema histona. Ona nastaju vezivanjem proteina koji specifično prepoznaju određene redoslede nukleotida u DNA i izmeštaju nukleozome tako što onemogućavaju vezivaje histona za DNA, olakšavajući inicijaciju transkripcije. Dva najvažnija načina za lokalno menjanje hromatinske strukture su kovalentna modifikacija histona i remodelovanje nukleozoma.
Kovalentna modifikacija histona
Gen aktivator proteini vezuju se za histon acetil transferazu (HATs), koja je poznata kao histon acetilaza. To je ATP-zavisan kompleks za remodelovanje hromozoma. Zahvaljujući hemijskim promenama histona, acetilaciji, oni se razdvajaju od molekula DNA. Na taj način je izvršeno remodelovanje hromozoma i omogućen pristup RNA polimerazi i transkripcija može da počne (slika 2).
Transkripciona kontrola
Transkripciona kontrola je od najvećeg značaja za većinu gena jer od nje zavisi koji će se geni prepisivati, a koji ne. Ključno mesto u regulaciji transkripcije zauzimaju gen-regulatorni proteini.
Gen-regulatorni proteini
Od gen-regulatornih proteina zavisi da li će se gen aktivirati ili inhibirati. Gen-regulatorni proteini se vezuju za specifične sekvence DNA duzine od 8-15 nukleotida i na taj način aktiviraju ili inhibiraju transkripciju (slika 3). Najčešće nekoliko gen-regulatornih proteina učestvuje u aktivnosti jednog gena. Čak je i kod bakterija potrebna interakcija bar dva različita regulatorna proteina da bi se promenila aktivnost gena, dok kod eukariota čitava grupa gen-regulatornih proteina deluje zajednički da bi se odredilo da li će doći do transkripcije. Jedan isti gen-regulatortni protein može modulirati sintezu različitih grupa enzima u različitim tipovima ćelija. Na taj način jedan gen-regulatorni protein ima različite funkcije u zavisnosti sa kojim će se proteinima kombinovati. Npr. receptor za steroidni hormon modulira sintezu različitih grupa enzima u različitim tipovima ćelija. To zavisi od gen-regulatornih proteina koji su bili prisutni u ćeliji pre sinteze steroidnog receptora. Kombinacija nekoliko gen-regulatornih proteina rezultuje pojavom velikog broja ćelijskih tipova -KOMBINATORNA REGULACIJA GENA. Npr. 25 različitih gen-regulatornih proteina može teoretski odrediti više od 10.000 tipova ćelija. Iz tog razloga se oni u ćeliji nalaze u malim količinama. Postoje gen-regulatorni proteini koji imaju odlučujuću ulogu u koordinaciji ostalih regulatornih proteina tj. kontrolišu aktivnost mnogih drugih gena. Na primer odsustvo receptora za testosteron dovodi do toga da se muški genotip (XY) razvije kao ženski. Znači jedan jedini protein može odrediti tip ćelije (ključni ili master gen-regulatorni proteini).
Sinteza gen-regulatornih proteina
Za sintezu gen regulatornih proteina su odgovorni liposolubilni hormoni koji lako prolaze kroz ćelijsku membranu. Receptori za ove hormone se nalaze u citosolu i imaju veliki afinitet prema njima. Vezivanje hormona za receptore izaziva konformacione promene u njihovoj strukturi što uslovljava aktivaciju receptora i povećanja afiniteta za određene sekvence DNA. To su gen-regulatorne sekvence i one su pod kontrolom steroidnih hormona. Sekvenca koja prepoznaje kompleks hormon-receptor ima funkcije ENHENSERA za gen čiju aktivnost reguliše steroidni hormon. Vezivanje kompleksa hormon-receptor za DNA ima primaran i sekundaran odgovor. Primaran odgovor je sinteza gen-regulatornih proteina, a sekundaran odgovor je uticaj tog gen-regulatornog proteina na druge gene. Sekundaran odgovor moze biti i prekid sinteze gen-regulatornih proteina i to je takozvana FEEDBACK KONTROLA. Primer sekundarnog odgovora je efekat koji hormon kortizol ima na druge gene. On uključuje gene samo u ćelijama koje sadrže kortizolske receptore koje, opet, uključuju neki drugi prekidači. Geni koje uključuje kortizol zauzvrat uključuju druge gene, a ti drugi ponekad uključuju još neke gene i tako dalje. Glavna svrha većine gena u ljudskom genomu da regulišu ekspresiju drugih gena u genomu. Zanimljivo je to da isti receptori steroidnih hormona regulišu različite gene u različitim ćelijama. Razlog tome je što se više od jedne vrste gen-regulatornih proteina mora vezati za regulatorne sekvence eukariotskog organizma da bi aktivirao njegovu transkripciju. Prema tome svaki steroidni hormon ima karakteristične fiziološke efekte, jer samo određene ćelije sadrže receptor za njega i što svaki od tih tipova ćelija sadrži različite kombinacije gen-regulatornih proteina.
Kontrola obrade primarnog RNA transkripta
Iako je kontrola inicijacije najbitnija za regulaciju mnogih gena, u kontroli ekspresije genoma su bitni i drugi nivoi. Ova kontrola podrazumeva obradu RNA transkripta. Primarna struktura primarnog RNA transkripta je komplementarna primarnoj strukturi DNA matrice sa koje se sintetisao RNA. Jedina razlika je sto RNA molekuli umesto timina (T) sadrze uracil (U). Poznato je da eukarioti u svojoj DNA matrici sadrze i nekodirajuće sekvence, koje se prepisivanjem prenose na RNA. Obrada primarnog RNA transkripta podrazumeva splicing (isecanje nekodirajućih sekvenci tj. Introna) capping i polyadenilaciju.
Obrada primarnih transkripata kovalentnim modifikacijama
Pre svega 5’ kraj molekula RNA koji se sintetiše u procesu transkripcije se modifikuje najčesce još dok transkripcija nije završena tako što mu se dodaje 7-metil-guanozin koji se vezuje 5’-5’trifosfatnim mostom za prvi ribonukleotid u nizu. Uz to, metiluje se 2’ hidroksilna grupa prve, a ponekad i druge riboze u nizu. Tako, transkript na svom 5’ kraju dobija strukturu koja je poznata kao 5’ kapa (Slika 4). Primarni transkript postaje pozitivan zbog metil grupe. Kapa na 5’ kraju je veoma bitna za vezivanje ribozoma za iRNA u procesu translacije. Uklanjanje 5’ kape dovodi do ubrzane degradacije iRNA u citoplazmi. U ćeliji postoje određeni regulatorni mehanizmi koji dodavanjem ili uklanjanjem 5’ kape utiču na intezitet translacije.
Na 3’ kraju primarnog transkripta takođe se vrši obrada. Ova obrada podrazumeva dodavanje niza od 100-200 ostataka adeninskih nukleotida na 3’ kraj primarnog transkripta (slika 5). To je takozvani 3’-poli(A) rep. Poliadenilaciju primarnog transkripta katalizuje enzim poli (A) polimeraza, a proces se odvija u dve faze. Mesto na kom počinje poliadenilacija nastaje terminacijom transkripcije. U eukariotskim ćelijama signal za poliadenilaciju je evolutivno očuvani niz AAUAAA. Kada se transkripcija završi, endonukleaza hidrolizuje primarni transkript na mestu 15 nukleotida nizvodno od signala za poliadenilaciju, a zatim poli(A) polimeraza dodaje poli(A) rep na novonastali 3’ kraj transkripta, katalizujući polimerizaciju ATP-a praćenu hidrolizom pirofosfata. Funkcija poli(A) repa još nije dovoljno poznata. Zna se da se u citoplazmi za njega vezuju proteini koji pakuju iRNA u RNP čestice štiteći ih od degradacije. Moguće je da je poli(A) rep važan i za splicing.
Obrada transkripata isecanjem introna
Primarni transkript RNA je nestabilan i samo mali njegov deo izbegne degradaciju. Eksperimentalni podaci su pokazali da se dužina novosintetisane RNA brzo smanjuje , tako da se za 30 min svede na dužinu citoplazmatične iRNA. U proseku primarni transkript sadrži oko 6000 nukleotida , a iRNA oko 1500 nukleotida. Ovo je ukazalo da postoji bitna razlika između prokariotskih i eukariotskih organizama. Kod prokarita nema naknadne obrade primarnog transkripta jer on sadrži kontinuirani niz nukleotida koji je šifra za sintezu proteina. Eukariotski primarni transkript sadrži nekodirajuće sekvence koje su kopije introna. Te sekvence se moraju iseći iz primarnog transkripta da bi nastale iRNA koje će kodirati proteine (slika 6). Eukariotski primarni transkript podleže obradi koja se sastoji od isecanja introna i predstavlja pored transkripcije i translacije još jedan korak u kome je moguće uticati na končanu ekspresiju gena.
Kontrola transporta iRNA
Kontrola transporta iRNA obuhvata mehanizme koji određuju koje zrele iRNA će se transportovati iz jedra u citoplazmu, pri čemu samo oko 5% od svih zrelih iRNA dospeva u citoplazmu. U ćeliji, RNA je od samog poćetka sinteze, pa sve do kraja svog životnog veka vezana za proteine za ribonukleoproteinske komplekse – RNP. Mnogi od proteina iz ovih kompleksa su veoma očuvani u toku evolucije, što ukazuje na njihov univerzalni biološki značaj, koji se po svemu sudeći, sastoji upravo u regulaciji transporta iRNA iz jedra u citoplazmu i njihove stabilnosti.
Kontrola translacije
Translacija (biosinteza proteina) obuhvata tri osnovne faze kontrolisane grupom različitih translacionih faktora.
- Inicijacija
Kod prokariota učestvuju tri inicijaciona faktora. Kao i ostali proteinski faktori translacije oni spadaju u kategoriju uslovno ribozomskih proteina, jer su vezani za ribozome samo u toku određenih faza translacije. U toku vezivanja velike subjedinice ribozoma za 30S inicijacioni kompleks inicijacioni faktori disosuju i više nemaju nikakvog uticaja na proces elongacije polipeptidnog lanca. Ta tri faktora su: IF-1 čija uloga još uvek nije sasvim jasna. Smatra se da on potpomaže delovanje IF-3, a pored toga da ima važnu ulogu u oslobađanju IF-2. IF-2 učestvuje u vezivanju inicijatorske tRNA za nekomplementarno P mesto na 30S subjedinici. On formira kompleks isključivo sa fMet-tRNA i na taj način obezbeđuje da samo inicijatorska tRNA može da učestvuje u inicijaciji. Pored toga on dovodi i do hidrolize GTP-a. IF-3 ima dvostruku ulogu: neophodan je za vezivanje male subjedinice za određeno mesto na iRNA i učestvuje u disacocijaciji ribozoma na subjedinice tj. kontroliše količinu slobodnih 30S subjedinica. Kod eukariota inicijacioni faktori su brojniji i kompleksniji nego kod prokariota iako obavljaju iste osnovne funkcije. Do sada je identifikovano više od 10 različitih inicijacionih faktora. Međutim, najbolje proučen faktor inicijacije kod eukariota je eIF-2 koji vezuje GTP, a zajedno sa njim i Met-tRNA.
- Elongacija
Vezivanje aminoacil-tRNA se odvija uz pomoć elongacionog faktora EF-T kod prokariota, odnosno EF-1 kod eukariota. Ovaj faktor je vezan za ribozom samo do trenutka dok se aminoacil-tRNA ne veže za A mesto, a zatim odmah napušta ribozom i vezuje se za drugu aminoacil-tRNA. U drugoj fazi, vezivanje kompleksa elongacionog faktora EF-G sa GTP-om dovodi do toga da se tRNA zajedno sa iRNA pomere u odnosu na malu subjedinicu tako da se peptidil-tRNA nađe u P mestu na obe subjedinice ribozoma, a deacilovana tRNA u E mestu na velikoj subjedinici. Interesantno je da ribozomi ne može da veže istovremeno i EF-T i EF-G tako da se elongacija odvija uz alternativno vezivanje i oslobađanje ovih faktora.
- Terminacija
Kada se jedan od stop kodona (UAA, UAG ili UGA) nađe u A mestu za njega se vezuje protein nazvan terminacionim faktorom. Kod prokariota postoje tri terminaciona faktora: RF-1, RF-2, RF-3. RF-1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG, RF-2 prepoznaje UAA i UGA, a RF-3 vezuje GTP i stimuliše aktivnost prva dva faktora. Kod eukariota postoji samo jedan faktor terminacije označen kao eRF.
Kotrola degradacije iRNA
Neke RNA opstaju satima ili danima dok se druge degradiraju već pola sata pošto su dospele u citoplazmu. Na stabilnost iRNA utiče poli-A rep na 3'-kraju koji sadrže skoro sve eukariotske iRNA. takođe na iRNA utiče i karakterističan niz nukleotida u 3' nekodirajućem delu iRNA u kome se često nalazi duplet AU koji utiče na ubrzanu degradaciju. U nekim slučajevima, degradacija iRNA je kontrolisana hormonima, tako da u zavisnosti od hormonskog statusa životinje jedna ista iRNA može imati različit poluživot.
Kontola aktivnosti proteina
Obuhvata posttranslacionu kontrolu tj. mehanizme za kovalentnu modifikaciju sintetisanih proteina i njihovog prevođenja u biološki aktivan oblik (slika 7). Najzastupljeniji tip je proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (formilmetionina) sa NH2-kraja polipeptida Česta modifikacija je i ograničena proteoliza tokom koje se inaktivni proteinski prekursori uklanjanjem određenih oligopeptida ili polipeptida prevode u aktivne proteine. Mnogi transmembranski i proteini namenjeni sekreciji sintetišu se sa tzv. signalnim peptidima na NH2-kraju koje uklanjaju specifične peptidaze. Poznato je takođe više od 150 različitih kovalentnih modifikacija aminokiselinskih bočnih grupa od kojih su najčešće: fosforilacije, acetilacija, glikozilacija, hidroksilacija i metilacija. Posttranslacione modifikacije proteina uključuju i vezivanje koenzima za proteinske komponente enzima. Ove modifikacije su ireverzibilne.
